胰腺癌组织中METTL14和GFPT1的水平表达与临床预后价值研究

檀占海，陈建荣，张吉发，周联明，单远洲(上海交通大学附属第六人民医院南院普外科，上海 201499)

胰腺癌恶性程度极高，预计到 2030 年将成为癌症相关死亡的第二大原因[1]。胰腺癌位置隐匿，发现时已为晚期，丧失最佳手术时机，五年生存率只有8%[2-3]。探究胰腺癌的机制，对寻找早期诊断和治疗靶点具有重要的价值。甲基转移酶14（methyltransferase 14，METTL14）是一种甲基转移酶，参与mRNA代谢、造血祖细胞分化等过程。近年来发现，METTL14在结直肠癌[4]、胃癌[5]等恶性肿瘤中表达上调，能促进非编码RNA XIST等的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰，增强肿瘤细胞的增殖及转移能力。谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1（glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1，GFPT1）是己糖胺途径的限速酶，能催化葡萄糖胺-6-磷酸的形成。研究发现，乳腺癌[6]、宫颈癌[7]等恶性肿瘤中GFPT1表达升高，参与促进肿瘤的恶性增殖及放化疗治疗耐药性的形成，与肿瘤患者的不良预后关系密切。目前胰腺癌中METTL14，GFPT1的表达及临床意义报道较少。本研究利用实时荧光定量PCR和免疫组织化学分别在mRNA水平和蛋白水平检测胰腺癌组织中METTL14，GFPT1的表达，探讨两者的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月～2018年1月于上海交通大学附属第六人民医院诊治的86例胰腺癌患者为本研究的研究对象。病例纳入标准：①术前无针对肿瘤的辅助治疗，术后病理检查明确为胰腺癌；②初次诊治；③临床随访资料完整。排除标准：①术前接受过抗肿瘤治疗；②并发其它类型肿瘤；③并发自身免疫系统疾病。男性50例，女性36例；年龄42～78（62.61±6.32）岁；根据2009年美国癌症联合会第7版胰腺癌分期标准进行肿瘤AJCC分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期43例，Ⅲ期3例；肿瘤分化程度：高中分化60例，低分化26例；肿瘤直径：≤4 cm者56例，＞4 cm者30例；肿瘤位置：胰头61例，胰体尾25例；有淋巴结转移41例。本研究经患者知情签字且本院伦理委员会审核批准通过。

1.2 仪器与试剂 Narodrop1000微量分光光度计（美国Nanodrop公司）；反转录试剂盒（北京全式金公司，货号11141ES10）；METTL14，GFPT1及GAPDH引物由上海生工公司设计并合成；PCR Master Mix（日本TAKARA公司，货号RR320A）；METTL14单克隆抗体（abcam公司，货号ab220030）；GFPT1单克隆抗体（abcam公司，货号ab25069）；SP-9000免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥公司）；CX31显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 荧光定量PCR检测：用Trizol法提取癌组织及癌旁组织中RNA，检测RNA的A260nm/A280nm介于 1.8～2.0。反转录为cDNA后进行荧光定量聚合酶链式反应。引物序列METTL14：上游：5’-AAAAGTTGACGCCGCATTCT -3’，下游5’- ACACT CCAGCTGGGCGACGAAAACCCUAA-3’；GFPT1：上游：5’- GGAATAGCTCATACCCGTTGG -3’，下游5’-TCGAAGTCATAGCCTTTGCTTT -3’，以GAPDH为内参，上游：5’- CTGGGCTACACTGAGCACC -3’，下游5’- AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG -3’。反应体系共20μl，包括cDNA 2μl，上游和下游引物各1μl，SYBR Green 10μl及DEPC水6μl。条件为：95℃ 5 min，95℃ 变性25 s，60℃ 退火30 s，70℃延伸15 s，变性退火延伸共35个循环。采用2-ΔΔCt值法表示METTL14 mRNA，GFPT1 mRNA的相对表达量。

1.3.2 免疫组织化学检测：将癌和癌旁组织10g/dl中性甲醛固定过夜，石蜡包埋切片，按照常规免疫组织化学染色步骤染色。中性树脂封片，200倍镜下观察METTL14，GFPT1蛋白染色情况并进行免疫组织化学染色评分（染色强度评分乘以染色面积）。将染色强度分为0分：无染色，1分：浅黄色，2分：棕褐色；染色面积分为0分：面积≤25%，1分：面积25%～50%，2分：面积≥50%。免疫组织化学染色评分＜2分为阴性，≥2分为阳性。

1.4 统计学分析 用SPSS20.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，数据呈正态且方差齐，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料用率表述，组间比较采用卡方检验。相关性分析采用Pearson线性相关分析及Spearman秩相关分析。生存分析采用Kaplan-Meier法（Log-rank检验）。单因素及多因素COX回归分析影响胰腺癌生存预后的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌和癌旁组织中METTL14mRNA，GFPT1 mRNA表达 胰腺癌组织中METTL14 mRNA（5.442±0.437），GFPT1 mRNA（6.521±0.516）表达高于癌旁组织（0.992±0.203，0.895±0.212），差异具有统计学意义（t=85.644，93.525,均P=0.000）。

2.2 胰腺癌和癌旁组织中METTL14，GFPT1蛋白表达 胰腺癌组织中METTL14蛋白棕黄色阳性染色主要位于细胞核，GFPT1蛋白棕黄色阳性染色主要位于细胞浆和细胞膜。胰腺癌组织中METTL14，GFPT1 蛋白表达阳性率分别为73.26%（63/86），69.77%（60/86），显著高于癌旁组织的14%（7/86），9.30%（8/86），差异具有统计学意义（χ2=75.545，65.765，均P=0.000）。见图1。

图1 胰腺癌和癌旁组织中METTL14，GFPT1蛋白表达（200×）

2.3 胰腺癌中METTL14与GFPT1表达的关系 Pearson线性相关分析结果表明，癌组织中METTL14 mRNA与GFPT1 mRNA的表达呈明显正相关（r=0.569，P=0.000）。Spearman秩相关分析结果，METTL14蛋白与GFPT1 蛋白表达呈明显正相关性（r=0.664，P=0.000）。

2.4 METTL14，GFPT1蛋白表达与临床病理特征的关系 见表1。低分化程度、AJCC分期Ⅱ～Ⅲ期及有淋巴结转移胰腺癌组织中METTL14，GFPT1蛋白表达阳性率分别高于高中分化程度、AJCC分期Ⅰ期及无淋巴结转移，差异具有统计学意义（均P<0.05）。

表1 METTL14，GFPT1蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.5 METTL14，GFPT1蛋白表达对胰腺癌患者生存预后的影响 见图2。随访2～36个月，无失访，死亡61例，三年生存率29.1%（25/86）。METTL14阳性、阴性表达组的三年生存率分别为14.29%（9/63），69.57%（16/23）。METTL14阳性表达组患者三年累积生存率低于阴性表达组患者，差异具有统计学意义（χ2=15.232，P=0.000）。GFPT1阳性、阴性表达组三年生存率分别为13.33%（8/60），65.38%（17/26）。GFPT1阳性表达组患者三年累积生存率低于低GFPT1阴性表达组患者，差异具有统计学意义（χ2=18.054，P=0.000）。

图2 Kaplan-Meier生存分析METTL14，GFPT1蛋白表达对胰腺癌患者生存预后的影响

2.6 单因素及多因素COX分析影响胰腺癌患者预后的因素 见表2，3。单因素及多因素COX回归分析结果，METTL14阳性，GFPT1阳性、肿瘤AJCC分期Ⅱ～Ⅲ期及有淋巴结转移是胰腺癌患者不良预后的独立危险因素。

表2 影响胰腺癌患者预后的单因素COX比例风险回归模型

表3 影响胰腺癌患者预后的多因素COX比例风险回归模型

3 讨论

胰腺癌是恶性程度较高的消化系统肿瘤，起病隐匿，疾病进展迅速，预后极差，五年生存率低于10%[8]。胰腺癌的治疗以手术及化疗等为主，但疗效欠佳。近年来随着肿瘤分子生物学研究的进展，研发出新的治疗药物及策略如免疫检查点阻断治疗、酪氨酸激酶抑制剂药物治疗等，使肿瘤患者获得良好的临床疗效[9]。因此，深入探索胰腺癌的发病机制，寻找新的临床治疗靶点，具有重要意义。

胰腺癌的发生发展过程与表观遗传学修饰异常有关，例如DNA或RNA甲基化修饰，乳酸化修饰等。m6A修饰是RNA转录后修饰中最为普遍的修饰方式，由m6A甲基转移酶，去甲基酶和m6A结合蛋白共同催化完成，广泛参与细胞分化、细胞应激及凋亡等细胞活动[10]。METTL14是一种新的m6A甲基转移酶，能够与METTL3结合形成异质性二聚体，参与调控RNA的代谢等过程[11]。近年来发现，METTL14在结直肠癌等恶性肿瘤中异常表达上调或下调，其通过促进高迁移率基因群4 mRNA的表达，促进结直肠癌细胞生长和侵袭[5，12]。本研究中，胰腺癌中METTL14表达显著升高，提示METTL14可能参与胰腺癌的肿瘤发生。既往有研究也证实，70%的胰腺癌中存在普遍的m6A修饰现象，METTL14是胰腺癌中主要的甲基转移酶[13]。研究表明，胰腺癌中CDC样激酶1/富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子5信号轴通过促进METTL14的选择性剪接,上调METTL14蛋白表达[14]。此外，与胰腺癌中METTL14的表达与不良临床病理特征有关，提示METTL14的表达参与促进胰腺癌的恶性发展。有研究报道，胰腺癌中METTL14通过m6A修饰PMP22相关p53效应子mRNA，增强胰腺癌肿瘤细胞增殖、侵袭和转移能力[14]。此外，METTL14的表达升高能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，间质性表型N-钙粘素表达上调，而上皮性表型如E-钙粘素表达下调，肿瘤细胞的侵袭及转移能力增强，促进肿瘤淋巴转移，导致肿瘤分期升高[15]。因此，胰腺癌中METTL14的表达促进胰腺癌的肿瘤进展，我们对胰腺癌患者进行随访，发现METTL14阳性表达患者生存预后较差，并且是影响胰腺癌患者不良生存预后的独立危险因素，表明METTL14可能是一种新的胰腺癌预后相关肿瘤标志物。笔者分析，METTL14阳性表达的胰腺癌肿瘤细胞的增殖及侵袭等恶性生物学行为更为显著，患者AJCC分期较高，容易发生淋巴结转移，导致患者不良生存预后。此外，METTL14表达上调还能通过激活RNA结合蛋白24/轴发育抑制因子的表达，增强非小细胞肺癌对顺铂治疗的耐药性形成，导致患者不良预后。因此，临床医生可根据METTL14的表达情况，对胰腺癌患者临床预后进行评估，并积极予以诊治，以改善患者预后。

己糖胺生物合成途径是糖酵解途径的一个分支，GFPT 是己糖胺生物合成途径的限速酶，可将6-磷酸果糖和谷氨酰胺催化为 6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸。人类 GFPT有三种亚型：GFPT1，GFPT2和GFPT3，其中GFPT1是最主要的也是表达最广泛的亚型。研究表明，GFPT1的表达升高能促进食管癌等恶性肿瘤的肿瘤增殖及转移，与患者较差的无进展生存期和总生存期有关[6]。但目前GFPT1在胰腺癌患者中的表达和预后价值尚未得到证实。本研究发现，胰腺癌中GFPT1表达上调，提示GFPT1可能参与胰腺癌的肿瘤发生。胰腺癌中GFPT1的表达上调与转录后调控异常有关。有学者发现，GFPT1的表达受到微小RNA-183-3p的调控，胰腺癌中微小RNA-183-3p的表达下调导致GFPT1 mRNA稳定性增加，促进GFPT1蛋白表达，诱导肿瘤增殖、转移及淋巴管生成[17]。我们研究还发现，GFPT1与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，提示GFPT1的表达升高参与促进胰腺癌的肿瘤进展。研究发现，GFPT1的表达增加能够促进抑癌基因磷酸酶张力蛋白同系物PTEN蛋白的泛素化降解，进而激活下游AKT信号通路，导致肿瘤的增殖和侵袭能力增强[7]。JIA等[18]研究表明，GFPT1的表达升高能够激活β-连环蛋白，在转录水平上调下游靶基因细胞周期蛋白D1和 MYC 的表达，促进胰腺癌细胞增殖、侵袭，抑制肿瘤细胞凋亡。本研究证实，胰腺癌中GFPT1阳性表达患者生存预后较差，是影响患者不良生存预后的独立危险因素。有学者报道，GFPT1的表达升高能够促进蛋白激酶A的磷酸化激活，激活Hippo/YAP通路，促进化疗耐药相关基因的表达，降低肿瘤对化疗治疗的敏感性[19]。另外，GFPT1作为己糖胺途径的限速酶，其表达上调能够促进溶酶体包裹的蛋白酶组织蛋白酶 B 的 N-乙酰氨基葡萄糖修饰，促进肿瘤转移和化疗耐药的形成，导致患者不良预后[20]。因此，检测胰腺癌组织中GFPT1的表达能够提示患者的预后，是一种新的胰腺癌预后相关肿瘤标志物。本研究中，METTL14与GFPT1的表达呈显著正相关。分析其原因，METTL14通过m6A修饰稳定插头框A2 mRNA，促进插头框A2的表达，而插头框A2能够在转录水平上调GFPT1的表达[21]。因此，胰腺癌中METTL14与GFPT1可能发挥协同促癌的生物学作用，但两者的具体作用机制有待深入研究。

综上所述，本研究发现，胰腺癌中METTL14，GFPT1表达升高，两者表达与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，共同参与促进胰腺癌的肿瘤进展，是新的胰腺癌患者预后相关肿瘤标志物。但本研究纳入研究的患者例数有限，并且未对两者在胰腺癌中的具体作用机制进行深入的实验研究，有待今后进行深入探索。