恶性黑色素瘤组织中circRNA_0020710和circRNA_0079593的水平表达及其临床价值

张晓宇，张亚茹，张 莹，蒋志芳，刘惠敏（保定市第二中心医院检验科，河北涿州 072750）

恶性黑色素瘤是一种恶性程度较高、预后较差的皮肤科肿瘤[1]。由于缺乏对致癌基因的了解和鉴定，使得恶性黑色素瘤的早期诊断及治疗存在局限性。近年来研究发现，环状核糖核酸（circular RNA，circRNA）在恶性黑色素瘤组织和正常组织中具有显著性差异表达，参与恶性黑色素瘤的发生发展，可能为该病的诊断及靶向治疗带来帮助[2-3]。以往的研究指出，circRNA_0020710及circRNA_0079593在恶性黑色素瘤中存在异常表达，参与疾病的发生发展过程，在恶性黑色素瘤的早期发现及指导治疗等方面均具有重要意义[4-5]。由此我们推测，circRNA_0020710及circRNA_0079593在恶性黑色素瘤中发挥关键作用，可能是恶性黑色素瘤的潜在分子标志物。然而，关于circRNA_0020710及circRNA_0079593是否可作为预测恶性黑色素瘤发生及疾病进展的生物标志物尚未清楚。因此，本研究通过检测恶性黑色素瘤组织circRNA_0020710及circRNA_0079593的表达，分析其诊断恶性黑色素瘤及预测淋巴结转移的价值，旨在为该病的诊疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 研究对象 61例皮肤恶性黑色素瘤患者选自2019年1月～2022年3月保定市第二中心医院，男性37例，女性24例，年龄35～72（55.62±10.18）岁。纳入标准：①符合中国恶性黑色素瘤规范化病理诊断专家共识(2017年版)[6]；②>18岁，行手术切除术，有完整临床资料和结果。排除标准：①已接受过其他方法治疗；②并发免疫性疾病、感染性疾病及其他恶性肿瘤者。22例患者发生淋巴结转移，39例患者无淋巴结转移；组织学分级，41例Ⅰ～Ⅱ级，20例Ⅲ～Ⅳ级；肿瘤部位：36例四肢和躯干（肢端），25例消化道、鼻和泌尿系黏膜（非肢端）；分化程度：34例中高分化，27例低分化。

1.2 仪器和试剂 ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；逆转录试剂盒，PCR试剂盒和Trizol试剂盒（Qiagen公司）；高速冷冻离心机（Eppendorf公司）。

1.3 方法 采集恶性黑色素瘤组织和正常组织（取距病灶>2cm的正常皮肤组织），使用Trizol试剂提取组织总RNA（将组织样本置于液氮内研磨，每50～100mg样本加Trizol 1ml），置于-80℃保存待检。circRNA_0020710及circRNA_0079593检测：circRNA_0020710引物（上游：5’-AGCACTGC TTGATGCTCGAACTA-3’，下游：5’-TATCGCCTAC GAGTACTACTG-3’），circRNA_0079593引物（上游：5’-AGACTAGCTATCTGATGAGAATA-3’，下游：5’-TACACGGTACAGCTCAATGTG-3’）。以甘油醛3-磷酸脱氢酶为内参基因（上游：5’-TCAGCTG ATGCTAGGAGCGTAT-3’，下游：5’-ACGACTGG CACTGTTACGCT-3’），用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测circRNA。反应条件为：95℃预变性5min（1个循环）；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，40个循环。采用2-△△Ct法计算circRNA表达水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。应用受试者工作特征（ROC）曲线分析circRNA_0020710及circRNA_0079593诊断恶性黑色素瘤及预测淋巴结转移的价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 恶性黑色素瘤组织中circRNA_0020710及circRNA_0079593表达 恶性黑色素瘤组织中circRNA_0020710及circRNA_0079593表达水平均明显高于正常组织（4.95±2.37 vs 1.84±0.92，2.70±1.15 vs 0.91±0.34），差异具有统计学意义（t=18.946，15.248，均P<0.001）。

2.2 circRNA_0020710及circRNA_0079593表达与恶性黑色素瘤患者的临床特征 见表1。恶性黑色素瘤患者circRNA_0020710及circRNA_0079593表达水平升高与组织分级Ⅲ～Ⅳ级、肿瘤部位、低分化及淋巴结转移有关，差异具有统计学意义（均P<0.001）。

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表达水平与恶性黑色素瘤患者临床特征的关系（±s）

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表达水平与恶性黑色素瘤患者临床特征的关系（±s）

类 别ncircRNA_0020710t值P值circRNA_0079593t值P值年龄（岁）＜55284.74±2.281.2140.1522.60±1.101.1640.173≥55335.21±2.462.86±1.24性别男375.07±2.411.1360.1772.65±1.080.9840.251女244.82±2.302.78±1.20组织分级Ⅰ～Ⅱ级413.87±1.9616.712<0.0012.15±0.9813.328<0.001Ⅲ～Ⅳ级206.35±3.463.60±1.76肿瘤部位肢端364.61±2.089.620<0.0012.36±1.0411.106<0.001非肢端255.62±2.743.48±1.71分化程度中高分化344.09±1.9415.708<0.0012.40±1.0310.415<0.001低分化276.14±3.183.42±1.68溃疡有295.30±2.511.6300.0942.92±1.281.4180.106无324.67±2.242.56±1.05淋巴结转移有226.80±3.7020.713<0.0014.02±1.8118.635<0.001无393.26±1.551.64±0.72

2.3 circRNA_0020710及circRNA_0079593对恶性黑色素瘤的诊断价值 见表2和图1。circRNA_0020710及circRNA_ 0079593诊断恶性黑色素瘤的最佳截断值为3.15和1.78，其诊断恶性黑色素瘤的曲线下面积均大于0.800，敏感度分别为84.6%和81.0%，特异度分别为82.4%和77.5%。

图1 circRNA_0020710及circRNA_0079593诊断恶性黑色素瘤的ROC曲线

表2 circRNA_0020710及circRNA_0079593对恶性黑色素瘤的诊断价值

2.4 circRNA_0020710及circRNA_0079593预测淋巴结转移的价值 见表3和图2。circRNA_0020710及circRNA_0079593预测淋巴结转移的最佳截断值为4.83和2.75，其预测淋巴结转移的曲线下面积均大于0.835，其敏感度分别为87.4%和84.0%，特异度分别为85.7%和80.8%。

图2 circRNA_0020710及circRNA_0079593预测淋巴结转移的ROC曲线

表3 circRNA_0020710及circRNA_0079593预测淋巴结转移的价值（%）

3 讨论

恶性黑色素瘤是一种侵袭能力强、恶性程度高，极易发生淋巴结及致死率高的皮肤癌，严重威胁人类健康[7]。最近有报道称，一些circRNA在恶性黑色素瘤中有差异表达，细胞或组织特异性表达使其成为合适的候选诊断或治疗生物标志物[8]。CONG等[8]研究指出，circRNA_0020710作为一种致癌基因，在恶性黑色素瘤中调控异常，并参与了癌变过程，对恶性黑色素瘤的发生发展影响较大。另有研究认为，circRNA_0079593参与恶性黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，可能在恶性黑色素瘤的癌变过程及治疗方面发挥重大的作用，临床应用前景较好[9]。

本研究显示，与正常组织比较，恶性黑色素瘤组织circRNA_0020710及circRNA_0079593表达水平均明显升高，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593在恶性黑色素瘤中呈高表达，其可能是促进恶性黑色素瘤发生的主要基因之一。KHORSANDI等[10]研究表明，一些circRNA_0025039在恶性黑色素瘤组织中显著上调，在恶性黑色素瘤的增殖、侵袭、转移和迁移中发挥关键作用，参与恶性黑色素瘤癌变的进展。本研究组织分级Ⅲ～Ⅳ级、肿瘤部位非肢端、低分化和淋巴结转移的患者，circRNA_0020710及circRNA_0079593表达水平均显著增加，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593表达水平升高与疾病进展有关，其高表达可能促进恶性黑色素瘤的进展过程。MONTICO等[11]研究发现，恶性黑色素瘤组织和细胞中circRNA_0084043显著上调，circRNA_0084043的高表达促进细胞增殖、迁移和生长，在恶性黑色素瘤的发生发展中起重要作用。

本研究circRNA_0020710及circRNA_0079593单项指标对恶性黑色素瘤诊断及其预测淋巴结转移均具有一定价值，其敏感度和特异度均较好，说明circRNA_0020710及circRNA_0079593可作为恶性黑色素瘤的诊断及预测淋巴转移的分子标志物，对疾病的诊断及预测淋巴结转移有很好的帮助。HAO等[12]研究发现，与正常对照组相比，circRNA_0079593在恶性黑色素瘤组织和细胞系中显著高表达，其过表达显著提高了恶性黑色素瘤细胞的增殖率和侵袭能力，可能是恶性黑色素瘤新的生物标志物。另有研究认为，circRNA_0079593作为恶性黑色素瘤发生的关键调控因子，参与疾病的发生发展、侵袭和转移，可作为恶性黑色素瘤潜在的诊断、治疗和预测生物标志物[13]。

综上所述，恶性黑色素瘤组织中circRNA_0020710及circRNA_0079593水平明显升高，与组织分级Ⅲ～Ⅳ级、肿瘤部位、低分化及淋巴结转移有关，其对恶性黑色素瘤诊断及预测淋巴结转移均具有很好的价值，可作为该病诊断及病情判断的分子标志物。但本研究病例来源较单一，样本量较少，未来仍需更多的临床研究进一步证实。