非酒精性脂肪肝病患者血清LncRNA PVT1表达水平与胰岛素抵抗及肝纤维化的相关性研究

李 轶，尚 立（西安市第九医院.血管介入科；.消化内科，西安 710054）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种慢性肝病，全球患病率为20%～30%，17%～22%患者无明显临床症状，NAFLD是纤维化、肝硬化甚至肝癌的必经阶段，因此早期评估患者病情对于治疗具有重要意义[1-2]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）可参与肝脏细胞多种生物学过程，如参与调节脂质代谢、糖代谢、炎性变化等，与肝炎、肝纤维化等疾病密切相关[3]。LncRNA浆细胞瘤转化迁移基因1（plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1）为LncRNA的一种，与肿瘤、心肌损伤、支气管哮喘等多种疾病有关[4]。研究显示，在肥胖病中，LncRNA PVT1可通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，参与脂肪细胞分化，加速脂质积累，而肥胖是NAFLD的危险因素[5]。另有研究显示，LncRNA PVT1通过竞争性结合miR-152表达，促进肝星状细胞激活，从而促进肝纤维化中的上皮间质转化过程，表明LncRNA PVT1与肝纤维化有关[6]。本研究探索NAFLD患者血清LncRNA PVT与胰岛素抵抗、肝纤维化的相关性，为NAFLD的病情评估及临床诊治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2020年8月～2022年4月西安市第九医院收治的143例NAFLD患者为观察对象（NAFLD组），其中男性83例，女性60例，年龄25～74（44.78±12.23）岁；其中高血压39例，糖尿病54例。纳入标准：①符合NAFLD诊断标准[7]；②经肝组织病理诊断是否发生肝纤维化；③患者基本资料完整。排除标准：①酒精性肝病；②晚期肝硬化、病毒性肝炎、药物性肝炎或自身免疫性肝病等；③肝脏手术史、肾功能不全患者；④感染性疾病、免疫系统疾病或并发恶性肿瘤者。选择同期性别、年龄相匹配的健康志愿者（肝功能检测、肝脏超声检查结果正常）140例为对照组，其中男性76例，女性64例，年龄26～75（45.65±11.36）岁；其中高血压30例，糖尿病35例。NAFLD组与对照组年龄、性别、高血压患者比例比较，差异无统计学意义（χ2/t=0.405，0.620，1.310，均P＞0.05），NAFLD组糖尿病患者比例显著高于对照组（χ2=13.929，P＜0.001）。

1.2 仪器与试剂 TRizol试剂（北京普利莱基因技术有限公司，货号：R1030），Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit（索莱宝生物科技有限公司，货号：K1642），2×SYBR Green PCR Mastermix（索莱宝生物科技有限公司，货号：SR1110），荧光定量 PCR 仪（瑞士罗氏公司，型号：Light Cycler 480 II），自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司，型号：BeckmanAU480），多功能酶标仪（美国赛默飞公司，型号：Varioskan LUX），全自动化学发光仪（美国贝克曼库尔特公司，型号：UniCel DxI 800 Access）。

1.3 方法

1.3.1 血清LncRNA PVT1水平检测：采集研究对象入院或入组24h内清晨空腹外周静脉血5 ml，离心后收集血清，-80℃保存备用。采用TRizol试剂提取血清总RNA，检测RNA浓度与纯度，使用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录合成cDNA。PCR引物由广州锐博生物科技有限公司合成，其中LncRNA PVT1上游引物序列：5’-CCTGGTGAAGCATCTGATGCACG-3’，下游引物序列：5’-GCCAGGCTTTGTGGCACACGC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-AATCCCATCACCATCT TC-3’，下游引物序列：5’-AGGCTGTTGTCATACTT C-3’，在RT-PCR系统使用2×SYBR Green PCR Mastermix进行PCR扩增，按照试剂盒说明书进行操作。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算LncRNA PVT1水平相对表达量。

1.3.2 其他指标收集：记录一般资料（年龄、性别、高血压、糖尿病史）。患者入院或入组24h内抽取清晨空腹外周静脉血10 ml，取其中一部分采用氧化酶法检测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG），其余部分离心后收集血清，-80℃保存备用，自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotranferase，AST）及血脂水平[总胆固醇（total cholesterol，TC），三酰甘油（triglyceride，TG），高密度脂蛋白-胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C），低密度脂蛋白-胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）]，化学发光法检测空腹胰岛素（fasting insulin，FIns），并计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FPG×FIns/22.5。酶联免疫吸附法检测血清肝纤维化指标，包括Ⅲ型前胶原（procollagenⅢ，PCⅢ）、Ⅳ型胶原（IV collagen，CⅣ）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（Laminin，LN）等。严格按照试剂盒说明书及仪器操作说明进行操作。

1.3.3 肝纤维化分级：通过病理诊断对患者进行肝纤维化分期评分[8]，共分为S0～S4级，其中S0为无纤维化；S1表示汇管区纤维性扩大，但没有纤维间隔形成；S2表示汇管区纤维性扩大，有少数纤维间隔形成；S4则为早期肝硬化；S0～S4期患者分别为67，23，19，17和17例。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0统计分析，计量资料符合正态分布和偏态分布分别以均数±标准差（±s）或中位数（四分位）[M(P25，P75)]表示，采用单因素方差分析和独立样本t检验或非参数秩和检验，计数资料采用（n，%）表示，采用卡方检验，Pearson分析NAFLD患者血清LncRNA PVT1与各指标相关性，Logistic回归分析影响NAFLD患者发生肝纤维化的影响因素。

2 结果

2.1 两组血清指标比较 见表1。与对照组比较，NAFLD组血清AST，ALT，FBG，HOMA-IR，TC，TG，LDL-C，PCⅢ，CⅣ，LN和HA水平显著升高，HDL-C水平显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 NAFLD组与对照组血清指标比较[±s，M(P25，P75)]

表1 NAFLD组与对照组血清指标比较[±s，M(P25，P75)]

项目对照组（n=140）NAFLD组（n=143）t/χ2值P值AST（U/L）24.35±8.5352.21±11.3323.3320.000 ALT（U/L）28.62±6.3542.36±8.4215.4740.000 FBG（mmol/L）5.34（9.65～6.71）8.23（5.31～10.90）11.3680.000 HOMA-IR1.68（1.26～2.61）2.31（1.52～3.95）7.8120.000 TC（mmol/L）4.26±0.535.31±1.0510.5850.000 TG（mmol/L）1.23±0.351.89±0.937.8690.000 LDL-C（mmol/L）2.82±0.753.51±0.926.9070.000 HDL-C（mmol/L）1.43±0.391.12±0.366.9500.000 PCⅢ（μg/L）95.34±12.63121.55±21.3212.5490.000 CⅣ（μg/L）54.34±8.3778.56±15.4216.3720.000 LN（μg/L）84.21±16.55110.36±25.4110.2350.000 HA（μg/L）82.43±14.2693.15±16.855.7710.000

2.2 不同胰岛素抵抗NAFLD患者血清LncRNA PVT1表达水平比较 对照组、NAFLD组患者血清LncRNA PVT1表达水平分别为1.05±0.18，1.79±0.52，差异有统计学意义（t=15.929，P＜0.001）；NAFLD中HOMA-IR＞2.69患者（n=78）血清LncRNA PVT1表达水平为2.08±0.45，显著高于HOMA-IR≤2.69患者（n=65）血清LncRNA PVT1表达水平1.44±0.48，差异有统计学意义（t=9.188，P＜0.001）。

2.3 不同肝纤维化分期NAFLD患者血清LncRNA PVT1表达水平比较 S0～S4期NAFLD患者血清LncRNA PVT1表达水平分别为1.41±0.35，1.72±0.40，2.01±0.33，2.31±0.32和2.62±0.24，且随着肝纤维化分期增加，血清LncRNA PVT1表达水平不断升高，差异有统计学意义（F=57.799，P＜0.05）。

2.4 LncRNA PVT1与糖脂代谢指标的相关性 相关性分析显示，血清LncRNA PVT1与FBG，HOMA-IR，TC，TG，LDL-C呈正相关（r=0.498，0.488，0.550，0.422，0.435，均P＜0.001），与HDL-C呈负相关（r=-0.534，P＜0.001）。

2.5 LncRNA PVT1与肝纤维化指标的相关性 相关性分析显示，LncRNA PVT1表达与PCⅢ，CⅣ，LN，HA呈正相关（r=0.451，0.404，0.525，0.421，均P＜0.001）。

2.6 肝纤维化的Logistic回归分析 见表2。以NAFLD患者是否发生肝纤维化为因变量（是=1，否=0），将FBG，HOMA-IR，TC，TG，LDL-C，PCⅢ，CⅣ，LN和HA为自变量进行Logistic单因素与多因素回归分析，结果显示，HOMA-IR，LncRNA PVT1是NAFLD患者发生肝纤维化的独立危险因素（P<0.05）。

表2 肝纤维化的Logistic回归分析

3 讨论

NAFLD包括多种肝脏病理学变化，其发病机制尚未完全明确，研究认为，NAFLD可能与胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应等因素有关，肝纤维化的发生是NAFLD患者预后的最重要预测因素，肝穿刺活检具有创伤性，寻找血清标志物具有重要意义[9-10]。

LncRNAs参与许多疾病的病理生理过程，通过对靶基因的调控，调控细胞增殖、能量代谢、炎症反应、自噬等过程，在肝癌、肝硬化、肝纤维化等疾病中发挥重要作用[11]。据报道显示，多种LncRNAs在NAFLD患者肝组织和血清中异常表达，与脂肪肝病变密切相关[12]。LncRNA PVT1属于LncRNA的一种，基因位于8q24，可调控细胞增殖、心肌细胞损伤、上皮间质转化、细胞自噬等多种生物学功能，与肝癌、炎症性疾病肾脏纤维化等疾病密切相关[13]。研究显示，LncRNA PVT1可调节糖尿病相关疾病，而糖尿病是NAFLD的常见并发症，LncRNA PVT1在糖尿病肾病足细胞上调表达，抑制LncRNA PVT1表达可抑制高糖诱导的足细胞损伤和凋亡[14]。ZHANG等[15]研究显示，NAFLD患者与NAFLD小鼠模型血清LncRNA PVT1表达水平升高，且与胰岛素抵抗有关，是胰岛素抵抗的独立危险因素。

本研究结果显示，NAFLD患者血清LncRNA PVT1表达水平显著高于对照组，且HOMA-IR＞2.69患者血清LncRNA PVT1表达水平高于HOMA-IR≤2.69患者，与ZHANG等[15]研究结果类似，提示LncRNA PVT1与NAFLD的发生和胰岛素抵抗有关。NAFLD的病理变化与肝细胞发生脂肪变性、脂质代谢紊乱有关，NAFLD患者存在血清糖脂代谢指标异常与胰岛素抵抗。本研究显示NAFLD患者FBG，HOMA-IR，TC，TG和LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低，提示NAFLD患者可能存在代谢紊乱，进一步相关性分析显示，血清LncRNA PVT1与FBG，HOMAIR，TC，TG和LDL-C呈正相关，与HDL-C呈负相关，提示LncRNA PVT1可能通过参与调节糖脂代谢参与NAFLD的发展。研究显示，在链脲佐菌素损伤的大鼠胰岛素瘤细胞中敲低LncRNA PVT1表达可改善STZ诱导的氧化应激和细胞凋亡，并提高胰腺β细胞的胰岛素分泌能力[16]。另有研究显示，LncRNA PVT1通过与 miR-30a的竞争性结合增强胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）表达，促进甲状腺乳头状癌的发展[17]。以上研究表明，LncRNA PVT1可能通过调节靶基因表达，调节胰岛素的分泌，导致胰岛素抵抗增加，当发生IR时，脂肪代谢减弱，导致游离脂肪酸增多，造成肝细胞内脂质沉积，导致脂肪肝的形成。

LncRNA PVT1还可调节纤维化过程，研究显示，LncRNA PVT1还可通过调节TGF-β1表达，细胞外基质积累，促进糖尿病肾病纤维化的进展[18]。肝纤维化过程表现为细胞外基质在肝内过量沉积，ECM相关分子PCⅢ，CⅣ，LN和HA在NAFLD患者血清中水平升高，可用于评估肝纤维化程度[19]。YU等[20]研究显示，LncRNA PVT1在四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝纤维化中表达水平升高，缺氧可增加LncRNA PVT1表达，LncRNA PVT1通过调控miR-152表达调节缺氧诱导的肝星状细胞自噬与活化。本研究结果显示，NAFLD患者血清LncRNA PVT1表达水平升高，且随着肝纤维化分期增加，血清LncRNA PVT1表达水平不断升高，相关性分析显示，LncRNA PVT1表达与PCⅢ，CⅣ，LN，HA呈正相关，提示LncRNA PVT1与肝纤维化程度有关，与以往报道类似，其可能的原因是LncRNA PVT1可能通过靶向调控基因表达调节肝星状细胞自噬与活化参与肝纤维化进程。Logistic回归分析结果显示，LncRNA PVT1是NAFLD患者发生肝纤维化的独立危险因素，提示LncRNA PVT1水平升高，NAFLD患者发生肝纤维化的风险较高，可能成为评估肝纤维化的标志物，检测LncRNA PVT1水平变化，有助于判断患者病情。

综上所述，NAFLD患者血清LncRNA PVT1表达水平升高，与胰岛素抵抗、肝纤维化相关，可能成为评估NAFLD患者病情的指标。本研究仅探索LncRNA PVT1与NAFLD患者胰岛素抵抗与肝纤维化相关性，其潜在的临床价值及参与肝纤维化的具体机制仍需做进一步研究。