经断调理丸的质量标准

杨 东

经断调理丸处方是由名老中医专家王光辉主任医师根据多年临床经验化裁而成，由牡丹皮、女贞子、墨旱莲、生地黄、熟地黄等15 味中药组成。经断调理丸具有滋肾潜阳、清心平肝的功效，临床常用于更年期综合征兼肾阴亏虚、心肝火旺证的治疗。女贞子、墨旱莲均归肝、肾经，常配伍使用起补益肝肾的作用[1-2]。文献[3-4]报道，女贞子和墨旱莲配伍，可明显影响更年期大鼠的激素和脂代谢水平，并能治疗女性绝经期骨质疏松症和激素缺乏导致的肥胖症。生地黄味甘，性寒，熟地黄味甘，性微温，两者配伍用于肝血亏虚、肾阴不足证[5-6]。牡丹皮、合欢皮和丹参合用起清心平肝、解郁安神之功[7-9]。牡丹皮主要有效成分是丹皮酚，高效液相色谱法（HPLC）含量测定常作为含牡丹皮中成药的质量控制标准[10]。为对经断调理丸的质量进行有效控制，本研究拟建立墨旱莲、合欢皮的显微鉴别，女贞子、丹参的薄层鉴别，以HPLC 测定牡丹皮的主要成分丹皮酚的含量为定量鉴别，以期建立可靠稳定的经断调理丸质量控制标准。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

女贞子对照药材（批号：121041-201905）；齐墩果酸对照品（批号：110709-201808，含量：91.7%）；丹皮酚对照品（批号：110708-201908，含量：99.9%）；丹酚酸B 对照品（批号：111562-201917，含量：92.24%）；经断调理丸（本院自制，每包装9 g，批号：211011、211012、211013）；色谱纯甲醇，其他试剂选用分析纯。

1.2 仪器

LC20A 型高效液相色谱仪、ATY124 型分析天平（岛津科技有限公司）；IX53 型奥林巴斯显微镜（北京瑞科中仪科技有限公司）；HH 型电热恒温水浴锅（江苏中大仪器科技有限公司）；AB135-S 型分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；硅胶G板（烟台市化学工业研究所）；HS3120 型超声波提取器（天津恒奥科技发展有限公司）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取经断调理丸适量，研成细粉，取少量涂匀载玻片，加水合氯醛1 滴，涂匀透化后置于显微镜下观察。由图1 可见，墨旱莲多为3 细胞非腺毛，长260～700 μm，其中基部细胞稍膨大，中部细胞较长，壁厚，且有明显突起呈疣状，顶端细胞近三角形，形状急尖而短。由图2 可知，合欢皮的纤维细长成束，直径范围在7～22 μm，草酸钙方晶分散于周围细胞中并形成晶纤维，含晶细胞壁木化或微木化，增厚且不均匀。

图1 墨旱莲的显微鉴别（非腺毛）

图2 合欢皮的显微鉴别（晶纤维）

2.2 薄层鉴别

2.2.1 女贞子的薄层鉴别 取适量的经断调理丸，研成细粉，取约10 g，置锥形瓶中，加甲醇20 ml，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，用无水乙醇-三氯甲烷（3∶2）混合溶液1 ml 溶解残渣，得到供试品溶液。取女贞子对照药材粉末1 g，按上法制成对照药材溶液。按经断调理丸处方比例取缺女贞子的其他药材，根据制备工艺制成去除女贞子的阴性对照品粉末，相同方法制备去除女贞子的阴性对照溶液。取适量齐墩果酸对照品，加甲醇溶解，得到浓度为1 mg/ml 的齐墩果酸对照品溶液。以上溶液各吸取5 μl，点样于同一硅胶G 薄层板上，选择环己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）展开剂，展开至距薄层板上沿1.5 cm 处时取出晾干后，10%硫酸乙醇溶液显色，置于105 ℃干燥箱中，至斑点清晰显色。由图3 可知，经断调理丸供试品薄层色谱中，女贞子对照药材与齐墩果酸对照品有相同的显色斑点，而缺女贞子阴性对照品无显色斑点。

图3 女贞子的薄层色谱

2.2.2 丹参的薄层鉴别 取经断调理丸适量，研成细粉，取约20 g，置锥形瓶中，加75%甲醇50 ml，超声40 min，滤过，将滤液浓缩至1 ml，作为供试品溶液。按经断调理丸处方比例取缺丹参的其他药材，根据制备工艺制得除丹参的阴性对照品，按上述方法制成阴性对照溶液。取丹酚酸B 对照品，溶于75%甲醇，制得2 mg/ml 的丹酚酸B 对照品溶液。吸取以上溶液各5 μl，点样于同一硅胶G 薄层板上，选择甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）为展开剂，展开至距薄层板上沿1.5 cm 处取出，于阴凉处晾干，在254 nm 波长紫外光下检视。由图4 可知，在薄层色谱板的相应位置上，经断调理丸供试品与丹酚酸B 对照品有相同的显色斑点，而阴性对照品无显色斑点[11]。

图4 丹参的薄层色谱

2.3 丹皮酚含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 取适量的丹皮酚对照品，精密称定，甲醇溶解制备丹皮酚对照品溶液，浓度为0.124 8 mg/ml。精密量取5 ml，置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得丹皮酚对照品溶液[12]，浓度为24.96 μg/ml。

2.3.2 供试品溶液的制备 取经断调理丸适量，研细，精密称定1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密量取25 ml 甲醇，密塞称重，超声提取（250 W，50 kHz）30 min，擦干锥形瓶放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.3.3 阴性对照溶液的制备 制备不含牡丹皮的经断调理丸其他药材粉末，精密称定1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密量取25 ml 甲醇，密塞称重，超声提取（250 W，50 kHz）30 min，擦干锥形瓶放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过，即得。

2.3.4 色谱条件 色谱柱为Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-水（38∶62）为流动相；检测波长：274 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min。

2.3.5 专属性考察 分别取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液，在2.3.4 项下色谱条件测定，记录色谱图。在“2.3.4”项下色谱条件，由图5～7 可知：在相同的保留时间位置上供试品溶液与丹皮酚对照品溶液有相应的色谱峰，而阴性对照溶液色谱中则无此色谱峰，说明经断调理丸处方中其他药味成分对丹皮酚的测定结果无干扰。

图5 供试品溶液的HPLC 色谱

图6 丹皮酚对照品溶液的HPLC 色谱

图7 阴性对照溶液的HPLC 色谱

2.3.6 线性关系的考察 精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 ml 对照品贮备溶液，均用甲醇稀释定容至25 ml，分别得到4.99、12.48、24.96、49.92、74.88 μg/ml的对照品溶液。在“2.3.4”项下色谱条件，分别进样，记录峰面积[13]。纵坐标为丹皮酚对照品的峰面积（y），横坐标为质量浓度（x），以此进行回归分析，得回归方程y=54 028x+256.6，r=0.999 9。表明在4.992～74.88 μg/ml 范围内丹皮酚含量与峰面积具有良好的线性关系。

2.3.7 精密度试验 在“2.3.4”项下色谱条件，对照品溶液连续进样6 次，记录峰面积[14]。计算得丹皮酚的峰面积相对标准偏差（RSD）为0.3%（n=6）。表明本实验所用仪器具有良好的精密度。

2.3.8 稳定性试验 供试品溶液室温下分别于3、4、5、6、7、8 h 取样，按照“2.3.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积[14]。计算得丹皮酚的峰面积RSD为0.4%（n=6），可知在室温下供试品溶液放置8 h内具有良好的稳定性。

2.3.9 重复性试验 称取6 份经断调理丸（批号211011）各1.0 g，按照“2.3.2”项制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算丹皮酚的含量[14]。结果显示，丹皮酚的平均含量为0.53 mg/ml，RSD 为1.6%（n=6），表明方法具有良好的重复性。

2.3.10 加样回收率试验 取经断调理丸（批号211011）适量，粉碎，称取6 份，每份精密称定0.5 g，分别置于具塞锥形瓶，加入浓度为0.124 8 mg/ml 丹皮酚对照品贮备溶液2 ml，加入甲醇23 ml，密塞称重，超声处理（300 W，50 kHz）30 min，放冷，甲醇补足失重，摇匀滤过，得到供试品溶液。按照“2.3.4”项下条件进样测定，记录色谱峰的峰面积并计算加样回收率[15]。回收率均在试验要求范围内，说明分析方法能够准确测量样品中的目标成分，并且样品处理过程中没有明显的损失。RSD 为0.2%，符合要求。见表1。

表1 6 份加样回收率试验结果

2.3.11 含量测定 适量取3 个批次经断调理丸，分别按照“2.3.2”项制备供试品溶液，按照“2.3.4”项进样测定，记录色谱峰的峰面积并计算丹皮酚的含量，复测2 次，得到平均值。见表2。

表2 经断调理丸中丹皮酚含量测定结果(n=2,mg/g)

3 讨论

本院经断调理丸的工艺是原药材全粉入药的加工形式。墨旱莲、合欢皮粉末显微特征明显，无干扰，因此，将墨旱莲、合欢皮显微鉴别作为质量控制标准之一。女贞子、丹参的薄层定性鉴别实验，在薄层色谱板的相应位置上，供试品与对照品有相同的显色斑点，而阴性对照品无相应显色斑点，表明阴性对照品无干扰[16-17]。丹皮酚HPLC 分离效果好，除含牡丹皮外处方中的其他药味无干扰；丹皮酚含量测定在4.99～74.88 μg/ml 范围内具有良好的线性关系；供试品溶液在8 h 内稳定性良好，加样回收率较好，丹皮酚HPLC含量测定可列入质量标准。本实验方法具有成分明确、方法可行、重复性较好的特点，能够用于检测经断调理丸的有效指标，有利于经断调理丸的质量保证和疗效发挥，提高治疗学意义，保障患者用药安全。