树莓RiPAL1基因克隆及生物信息学分析

孙华军，刘盈，李雪静，杨斯琪，钱丽丽，李跃

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163316）

树莓（Rubus idaeusL.）属于蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属多年生小灌木，又称覆盆子、托盘、木莓等[1]。成熟的树莓果实色泽宜人、酸甜适口、软嫩多汁，富含多酚、类黄酮和花青素等多种有益活性成分及人体必需的氨基酸，具有增强免疫力和抗癌的功效[2-4]。由于富有极高的营养价值，树莓也被誉为“第三代黄金水果”[5,6]。苯丙烷代谢途径是植物重要的次级代谢途径之一，该途径会产生多种活性成分，如黄酮、多酚和花青素等[7]。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia-Lyase，PAL）是苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶，通过催化L-苯丙氨酸产生反式肉桂酸，反式肉桂酸是植物合成黄酮类等次级代谢产物的前体物质，是调控下游黄酮类成分合成信号通路的关键成员[8]。黄酮类化合物是一类重要的次生代谢天然有机化合物，具有抗氧化等生物学功能，可清除体内的自由基和毒素，能抗菌、消炎、抗肿瘤，对人体健康大有裨益[9]。树莓中含有丰富的黄酮类和花色苷等酚类物质，对预防心血管疾病和肿瘤等有良好效果[10,11]。FAO推荐其为“生命之果”[12]。

研究表明，PAL与黄酮积累有关，刘金福等[13]研究发现，苦荞黄酮的产生与PAL活性呈正相关。赵则海等[14]对攀援型和矮生型四棱豆的苯丙氨酸解氨酶活性和黄酮含量进行了比较，发现在两种不同类型的四棱豆中，PAL活性和总黄酮含量之间均呈显著正相关。在树莓中，一氧化氮处理能通过增强PAL和其他相关酶活性，加快黄酮和总酚的积累速率，提升果实的抗氧化能力[15]。目前，已对云锦杜鹃[16]、百蕊草[17]、牛大力[18]和陆地棉[19]等多种植物的PAL基因进行了克隆、序列分析以及蛋白质的功能研究，而有关树莓PAL基因的研究报道仍较少。关于树莓中黄酮类次生代谢物的代谢机制和调控机理尚未深入研究，研究调控树莓黄酮类代谢的关键基因的序列和结构等信息，对于阐明树莓类黄酮的代谢机理至关重要。

因此，本研究根据前期树莓转录组数据，采用逆转录多聚酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）法克隆获得RiPAL1基因序列，利用生物信息学分析软件对该基因进行生物信息学分析，明确RiPAL1基因的序列、结构和亲缘信息，以期为研究树莓RiPAL1基因在黄酮类物质生物合成中的转录调控作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料

树莓果实采自于黑龙江省尚志县浆果基地，采摘后立即运回实验室，用液氮快速冷冻后于-80 ℃保存。

1.2 主要仪器设备

RNA提取试剂盒，康为世纪生物科技有限公司；cDNA逆转录试剂盒和2×3 G Taq Master Mix，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；引物合成和测序技术服务由金唯智生物科技有限公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 树莓果实RNA提取及cDNA第一链的合成

从-80 ℃冰箱中取出树莓果实样品，于液氮中迅速研磨成粉末状，参照CWBIO OminiPlant RNA Kit（DNAse I，适用于多糖多酚）试剂盒说明书提取总RNA。再参照HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书合成cDNA第一链。

1.3.2 树莓RiPAL1基因的克隆

从本实验室已有的树莓转录组数据中获得RiPAL1基因序列，用primer premier 6.0软件设计RiPAL1基因的特异性引物（F：ATGGAGTTTAATAAA AACGGC；R：TTAAGATATAGGCAGGGG）。PCR扩增反应体系为50 μL，包含25 μL的2×3G Taq Master Mix，2 μL上游引物，2 μL下游引物，1 μL树莓果实cDNA，20 μL灭菌水。PCR反应的条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min；共33个循环，72 ℃彻底延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用1%（m/m）的琼脂糖凝胶电泳检测。目的条带单一且明亮则送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.3.3 树莓RiPAL1基因的生物信息学分析

测序无误的树莓RiPAL1基因序列用ORF finder软件预测其完整开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）。在线预测树莓RiPAL1基因编码氨基酸的蛋白保守结构域及超家族。利用在线软件预测树莓RiPAL1基因编码蛋白理化性质（ExpasyProtParam）、信号肽（SignalP 4.1）、跨膜结构（TMHMM 2.0）、糖基化位点（NetNGlyc 1.0）、磷酸化位点（NetPhos 3.1）和亲疏水性（ExPasy-ProtScale）并进行分析。使用SOPMA软件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）预测蛋白二级结构，使用SWISS-MODEL软件预测蛋白三级结构。通过DNAMAN软件进行氨基酸多序列比对，采用MEGA 7软件的Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.3.4 数据分析

在NCBI blastn中比对PCR产物测序后得到的基因序列，并命名为树莓RiPAL1基因。使用NCBI中的BlastP工具查找与树莓RiPAL1同源性较高的蛋白。

2 结果与分析

2.1 树莓RiPAL1基因的克隆及序列分析

提取树莓果实RNA后，将其逆转录为cDNA第一链。以cDNA为模板，F（ATGGAGTTTAATAAAAAC GGCAAC）和R（TTAAGATATAGGCAGGGGGGCAC）为引物进行RiPAL1基因的全长扩增，电泳结果显示在2 000 bp偏上处有条带单一的高亮度目标条带（图1）。将剩余的PCR产物进行测序，得到全长为2 133 bp的基因序列，经NCBI blastn比对后命名为树莓RiPAL1基因。

图1 树莓RiPAL1基因PCR扩增产物电泳Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of RiPAL1 gene in respberry

利用ORF finder确定RiPAL1基因的开放阅读框为2 133 bp（图2a），编码710个氨基酸（图2b）。

图2 RiPAL1开放阅读框（a）及编码区氨基酸序列（b）Fig.2 Open reading frame (a) and coding amino acid sequences of RiPAL1 (b)

2.2 RiPAL1编码蛋白的理化性质分析

关键保守结构域是蛋白发挥催化功能的基础。对树莓RiPAL1编码蛋白的保守结构域分析表明，RiPAL1蛋白包含PLN02457结构域，属于Lyase_Ⅰ_Like超家族（图3）。在RiPAL1蛋白的192～208位氨基酸处是苯丙氨酸解氨酶典型的酶活性中心，序列为GTITASGDLVPLSYIAG（图2b)。利用ExPASy-ProtParam在线软件对RiPAL1蛋白的理化性质进行分析，预测其分子式为C3422H5491N949O1045S27，相对分子量为77.50 ku，总原子数为10 934，理论等电点为6.21，不稳定系数为35.00（＜40.00），推测为稳定蛋白。半衰期约为30 h，在构成树莓RiPAL1蛋白的20种氨基酸中亮氨酸（Leu）的比例最高，为10.80%；色氨酸（Trp）的比例最低，为0.60%。脂肪族氨基酸616个，占86.80%；芳香族氨基酸39个，占5.50%；酸性氨基酸85个，占12.00%。对RiPAL1蛋白的信号肽预测分析结果表明，RiPAL1是一种无信号肽蛋白，从而推测其可能是非分泌蛋白（图4）。TMHMM 2.0在线软件预测结果显示，RiPAL1蛋白不存在跨膜结构（图5）。利用ExPasy-ProtScale软件在线预测编码蛋白的亲疏水性，结果显示RiPAL1蛋白疏水性最大值为4.50，最小值为-4.50，平均疏水指数为-0.49，故推测该蛋白为亲水性蛋白（图6）。

图3 RiPAL1蛋白的功能结构域分析Fig.3 Analysis of functional domain of RiPAL1 protein

图4 RiPAL1蛋白的信号肽预测Fig.4 Prediction of signal peptides of RiPAL1 protein

图5 RiPAL1蛋白的跨膜结构域预测Fig.5 Prediction of potential transmembrane domains of RiPAL1 protein

图6 RiPAL1蛋白的亲疏水性预测Fig.6 Prediction of hydrophobicity of RiPAL1 protein

2.3 RiPAL1蛋白的糖基化位点和磷酸化位点分析

生命活动中离不开蛋白质，在细胞中信号转导包括磷酸化和去磷酸化两个主要部分，其中蛋白质磷酸化是调节酶活性的关键环节[20]，并影响蛋白质活性和亚细胞鉴定[21]。蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的主要方式之一，直接或间接影响蛋白质自身的活性、稳定性以及亚细胞定位[22]，指由蛋白激酶（Protein Kinases，PKs）催化的，将三磷酸腺苷（ATP）的磷酸基团转移到底物蛋白特定氨基酸残基上的过程，广泛参与植物生命过程的调节[23]。蛋白质磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3类氨基酸残基上[24]。通过NetNHlyc 1.0软件在线预测RiPAL蛋白的糖基化位点，发现在RiPAL1蛋白中存在4个潜在N糖基位点，分别为NGTA254、NLTG436、NPSL442和NTSI606（图7）。通过NetPhos 3.1软件在线预测RiPAL1蛋白的磷酸化位点，共发现105个可能存在的磷酸化位点，其中共分析出67个特异性激酶位点，包括38个丝氨酸（S）、22个苏氨酸（T）、7个酪氨酸（Y），其中酪氨酸主要分布在第102、324、345、428、429、447、572氨基酸处（图8）。

图7 RiPAL1蛋白的糖基化位点分析Fig.7 Analysis of glycosylation sites of RiPAL1 protein

图8 RiPAL1蛋白的磷酸化位点预测Fig.8 Prediction of phosphorylation sites of RiPAL1 protein

2.4 RiPAL1蛋白的二级结构和三级结构预测

通过SOPMA软件在线预测RiPAL1蛋白的二级结构，分析发现RiPAL1蛋白中的氨基酸主要参与形成了α螺旋（Hh）、无规则卷曲（Cc）、延伸链（Ee）和β折叠（Tt）结构，占比分别为54.93%、31.13%、7.61%和6.34%（图9）。利用Phyre 2在线软件，以欧芹（Petroselinum crispum）PAL酶（PDB：1W27）的晶体结构为模板对树莓RiPAL1的三级结构进行预测，其预测部分的可信度为100%，两者序列相似性高达84%，RiPAL1蛋白以α-螺旋结构为主，由四个同型蛋白单体组成四聚体（图10）。

图9 RiPAL1蛋白二级结构预测Fig.9 Prediction of secondary structure of RiPAL protein

图10 RiPAL1蛋白三级结构预测Fig.10 Prediction of tertiary structure of RiPAL1 protein

2.5 RiPAL1蛋白的同源性分析及系统发育树构建

使用NCBI中的BlastP工具查找与树莓RiPAL1同源性较高的蛋白，利用DNAMAN中的多序列比对对包括树莓RiPAL1蛋白在内的13种植物的PAL蛋白氨基酸序列进行同源性比对，结果发现不同植物的PAL蛋白长度存在一定的差异性，但序列一致性高达91.83%，RiPAL1和其他物种PAL氨基酸序列中均含包含一段典型的PAL酶家族保守结构域（GTITASG DLVPLSYIAG），表明PAL氨基酸序列在不同物种中高度保守（图11）。利用MEGA7对树莓RiPAL1和其它植物PAL的氨基酸序列进行系统进化树分析，结果表明树莓RiPAL1与草莓FaPAL1、月季RcPAL1和玫瑰RrPAL亲缘关系最近，它们都属于蔷薇科植物，该聚类结果基本符合植物形态学分类规律（图12）。

图11 RiPAL与其他植物PAL的多序列比对Fig.11 Multiple alignment of the RiPAL protein with other plant PAL proteins

图12 RiPAL与其他植物PAL的系统进化树分析Fig.12 A phylogenetic tree between RiPAL and other plant PAL

2.6 其他植物PAL分析

研究表明，PAL与黄酮积累有关，刘金福等[13]在研究苦荞中的黄酮发现，苦荞中黄酮的产生与PAL活性呈正相关。赵则海等[14]在研究攀援型和矮生型四棱豆中的黄酮发现，在两种不同类型的四棱豆中，总黄酮含量和PAL活性之间均呈显著正相关。王俊文等[15]在研究树莓中的黄酮发现，NO处理能显著提高苯丙烷代谢中的PAL和SKDH等关键酶活性，加快了苯丙烷代谢能力，从而促进下游产物如黄酮类物质的积累。在蓝莓和苹果中也有类似的结果[25,26]。目前，在对多种植物的PAL基因克隆、序列分析以及蛋白质的功能研究中，吕思佳等[16]发现云锦杜鹃组织中的苯丙氨酸含量与RhPAL基因表达量呈高度相关。张文香等[17]发现PAL是百蕊草中黄酮类成分合成调节的关键。耿晓姗等[18]发现PAL是苯丙烷代谢途径的关键酶，在植物的类黄酮类物质的合成中起着重要作用。杨郁文等[19]发现PAL是苯丙烷类代谢途径的关键酶，与植物抗病性密切相关。表明PAL基因对调控黄酮代谢有重要作用，因此展开对树莓黄酮代谢中PAL基因的解析，是揭示影响树莓黄酮类活性物质生物合成机制的关键环节。

3 结论

本研究基于树莓转录组测序结果，从树莓中克隆了RiPAL1基因，该基因编码710个氨基酸组成蛋白，该蛋白属于苯丙氨酸解氨酶家族成员。通过对树莓RiPAL1基因进行生物信息学分析，结果显示，RiPAL1蛋白为无跨膜结构和信号肽的亲水性蛋白，相对分子量为77.50 ku，总原子数为10 934，理论等电点为6.21，半衰期约为30 h。在构成树莓RiPAL1蛋白的20种氨基酸中亮氨酸（Leu）的比例最高，为10.80%；色氨酸（Trp）的比例最低，为0.60%。脂肪族氨基酸616个，占86.80%；芳香族氨基酸39个，占5.50%；酸性氨基酸85个，占12.00%。RiPAL1蛋白中发现105个可能存在的磷酸化位点，其中共分析出67个特异性激酶位点，其中丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化位点较多，酪氨酸残基的磷酸化位点较少，此外RiPAL1蛋白还存在4个潜在N糖基位点，所预测出的磷酸化和糖基化位点可为研究树莓RiPAL1蛋白的翻译后修饰提供参考。RiPAL1蛋白以α-螺旋结构为主，由四个同型蛋白单体组成四聚体。多序列比对表明RiPAL1蛋白具有较强的保守性。系统发育树分析表明树莓RiPAL1蛋白与同为蔷薇科的草莓、月季和玫瑰聚为一支，推测RiPAL1蛋白可能在蔷薇科植物的进化过程中高度保守，为今后深入研究蔷薇科植物的进化提供参考。

本研究利用RT-PCR法成功克隆出树莓RiPAL1基因，并利用生物信息学方法对RiPAL1蛋白进行了理化性质、二级和三级结构预测，以及同源性分析和系统进化树构建，阐明了该基因重要的分子特征，试验结果为进一步深入研究树莓黄酮类化合物的合成和基因调控奠定了理论基础。