镉胁迫对不同谷子品种种子萌发特性的影响

范利荣，晁 赢，阎祥慧，王建新，诸葛玉平，娄燕宏，王 会，潘 红，杨全刚

（1.土肥资源高效利用国家工程研究中心 / 山东农业大学资源与环境学院, 山东 泰安 271018；2.泰安高新技术产业开发区科技创新部, 山东 泰安 271000；3.岱岳农业农村局, 山东 泰安 271000）

土壤重金属污染受关注程度日益提高，据报道，我国农田土壤重金属污染面积约为2.5 × 108m2，每年生产的受污染粮食多达1.2 × 107t，造成的经济损失至少200 亿元[1-2]。尤其值得特别关注的是，土壤镉污染问题较为突出，据2014 年《全国土壤污染状况调查公报》显示，其点位超标率为7.0%[3-4]。镉污染具有隐蔽性、长期性及强致毒性等特点，同时其在土壤中的迁移能力较强，可通过食物链的富集对食品安全和人体健康构成严重的威胁[5-6]。因此，如何有效开展受镉污染农田的安全利用成为当前亟需解决的问题。

在镉污染土壤上种植镉低积累型品种，一方面可生产出符合国家食品卫生标准的农产品，另一方面可应用于土壤镉污染的修复。目前，已经筛选获得耐镉小麦(Triticum aestivum)[7]、水稻(Oryza sativa)[8]、菜豆(Phaseolus vulgaris)[9]等。但是，对于谷子(Setaria italica)等特色粮草兼用作物耐镉品种的筛选尚未见报道，种子萌发期作为作物生长发育的关键时期，其生长状况直接影响以后各生长发育阶段及产量和品质，在萌芽期进行耐性的鉴定，具有操作简便、可重复性强、环境污染小的优点[10-12]。严加坤等[13]对3 份谷子品种进行镉胁迫处理，通过测定萌发期的指标，筛选出综合抗逆性最强的‘豫谷31 号’。另有研究在80 μmol·L-1镉胁迫下，通过对尾穗苋(Amaranthus caudatus)萌发期指标进行分析，从16 份尾穗苋种质中筛选出5 份耐镉能力强的种质[12]。本研究选用主栽区且应用广泛的58 份谷子品种，采用双层滤纸法在100 mg·L-1镉溶液进行萌发试验，通过测定谷子品种的芽长、根长，利用主成分分析、聚类分析、隶属函数法对其相对指标进行谷子品种萌发期耐镉性综合评价[14-15]，以期筛选出低镉积累型谷子品种为耐镉育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究所用品种均为我国谷子主要种植区的主栽品种，来源于辽宁、山西、河北、山东、吉林、北京等地区，具体名称及来源如表1 所列。

表1 供试材料名称及来源Table 1 Varieties and sources of the test material

1.2 试验处理

根据预试验(设置0、50、100、150 mg·L-1共4个镉浓度梯度)确定进行耐镉筛选的镉处理浓度为100 mg·L-1。试验选取饱满的谷子种子，用蒸馏水清洗，再用3.5%次氯酸钠溶液浸泡5 min，然后用75%乙醇漂洗30 s[16]，最后用无菌蒸馏水多次漂洗。挑选出大小均匀的种子置于铺有双层滤纸的一次性培养皿(直径11 cm)中，每皿20 粒。向培养皿中加入4 mL 的100 mg·L-1氯化镉溶液以湿润滤纸，并以蒸馏水作为对照，为保持滤纸湿润采用称重法及时补充相应浓度的镉溶液。所有培养皿置于人工智能培养箱中培养(发芽前避光处理，昼夜温度25 ℃/19～21 ℃，箱内湿度设置在75%～80%，2 d 后设置光周期为16 h/8 h)。当胚芽达到种子长度一半或胚根达到种子长度记为发芽，每2 d 记录种子发芽情况，培养8 d 后用10 cm 直尺测量胚根与胚芽长度，每个处理3 次重复，共174 皿，随机排列。谷子种质发芽势、发芽率根据GB/T 5520－2011 《粮食、油料检验种子发芽试验国家标准》公式计算。

相对发芽率 = 处理发芽率/对照发芽率 × 100%；

相对发芽势 = 处理发芽势/对照发芽势 × 100%；

相对芽长 = 处理芽长/对照芽长 × 100%；

相对根长 = 处理根长/对照根长 × 100%。

1.3 数据处理

采用Excel 进行数据处理，运用SPSS 22.0 进行相关性分析、聚类分析、主成分分析，运用Origin 进行频率分析。将谷子品种的发芽率、发芽势、相对发芽率、相对发芽势以平方欧式距离作为供试谷子种质间距离，以最短距离法为聚类方法，进行聚类分析，建立种质资源聚类树状图。隶属函数值X(ij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)[17]。X(ij)表 示i品 种j指 标隶属值，Xij表示i品种j指标测定值，Xjmax为j指标测定最大值，Xjmin为j指标最小值。

式中：Pj代表各材料第j个综合指标的贡献率。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫对谷子种子萌发的影响

镉胁迫下，谷子种子萌发特性受基因型影响较大(表1)。其中，GZ05 在镉胁迫下未发芽，说明此品种对镉胁迫十分敏感，受镉影响严重。频率分析表明(图1)，58 份谷子的芽长、根长、发芽率、发芽势均值分别为0.81 cm、1.19 cm、30.00%、19.00%，变异系数分别为32.68%、60.55%、65.67%、65.35%，根长变异系数 > 芽长变异系数，说明根长比芽长更易受到镉胁迫的影响，这可能与根是植物首先接触重金属镉的器官有关。

图1 谷子种质芽长、根长、发芽率、发芽势频率分析Figure 1 Analysis of bud length, root length, germination rate, and germination potential frequencies of millet accessions

58 份谷子品种的相对发芽率和相对发芽势均值分别为40.07%和35.22%，两指标的变异系数分别为57.56%和57.80% (表2)，说明镉胁迫对谷子萌发生长的影响在基因型间差异较大。58 份谷子品种的相对芽长、相对根长均值分别为64.31%和19.96%，变异系数分别为29.53%和50.83%，相对根长的变异系数大于相对芽长，说明在同浓度镉胁迫下，根长比芽长更易受到镉胁迫的影响，这与镉胁迫下盐芥(Thellungiella hallophila)的研究结果[18]相似。

2.2 主成分分析

通过对镉胁迫下8 个萌发指标进行主成分分析，选择特征值 > 1 的成分，提取出3 个主成分(表3)。3 个主成分因子累计贡献率为89.81%，说明提取的3 个主成分能够代表原来8 个指标信息的绝大部分信息。

表3 3 个主成分的特征值、贡献率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of three principal components

根据3 个主成分系数，得到Y1、Y2、Y3的线性组合：

式中：X1为发芽率，X2为发芽势，X3为相对发芽率，X4为相对发芽势，X5为相对根长，X6为根长，X7为相对芽长，X8为芽长。在主成分Y1中，发芽率、发芽势、相对发芽率、相对发芽势的系数绝对值大于其他变量的系数绝对值，所以主成分Y1是4 个萌发指标的综合反映，代表谷子种质在镉胁迫下的萌发情况，说明这4 个萌发指标对筛选谷子耐镉性是必不可少的。在主成分Y2、Y3中，相对根长、根长、相对芽长、芽长的系数绝对值大于其他变量的系数绝对值，代表谷子种质在镉胁迫下的生长情况。

表4 是根据主成分方程(即上述的3 个线性组合方程)计算的主成分得分和综合得分(Y= 0.4852Y1+ 0.2811Y2+ 0.1318Y3)，综 合 得 分 > 1 的 种 质 有11 份： GZ12、 GZ11、 GZ55、 GZ17、 GZ02、 GZ43、GZ03、GZ53、GZ50、GZ41、GZ18，说明在镉胁迫下这11 份种质萌发生长情况较好；有31 份种质综合得分 < 0，说明受镉胁迫影响较大。

2.3 谷子品种耐镉性综合评价

2.3.1 聚 类分析

运用系统聚类对谷子品种的发芽率、发芽势、相对发芽率、相对发芽势进行聚类分析(图2)，58 份谷子种质可分为3 个类群：A 类包括GZ02、GZ03、GZ09、GZ11 等12 个品种(占比20.7%)，属于耐镉型，其发芽率 > 50%，相对发芽率、相对发芽势均 > 60%；B 类包括GZ23、GZ06、GZ44、GZ15 等13 份种质(占比22.4%)，属于中间型，其发芽率为25%～55%，相对发芽率为40%～65%，相对发芽势为30%～45%；C 类包括GZ16、GZ33、GZ25、GZ30等33 份种质(占比56.9%)，属于镉敏感型，其发芽率 < 20%，相对发芽率 < 40%，相对发芽势 < 38%。

图2 谷子种质聚类分析树状图Figure 2 Millet germplasm cluster analysis dendrogram

2.3.2 耐 镉性综合评价

利用隶属函数对谷子萌发指标(发芽率、发芽势、相对发芽率、相对发芽势)计算综合得分，对58 份谷子种质耐镉性进行综合评价(表5)。选取排名前8 的为耐镉品种(综合得分 > 5.00)，分别是GZ02、 GZ43、 GZ12、 GZ11、 GZ17、 GZ55、 GZ03、GZ50，结合聚类结果发现8 个品种属于聚类分析中的耐镉型品种，相对发芽率、相对发芽势均≥ 60%，占比13.8%。

表5 58 份谷子种质的耐镉性综合评价值Table 5 Comprehensive evaluation of the cadmium tolerance of 58 millet germplasms

3 讨论与结论

作物丰富的种质资源表现出相应的遗传多样性。从作物种质中筛选耐镉品种是开展植物修复的基础，而种子萌发在作物生育期属于起始点，在胁迫条件下，种子萌发及出苗情况可作为鉴定抗性的重要指标[19]。采用双层滤纸法在100 mg·L-1镉胁迫下，58 份谷子品种的相对发芽率和相对发芽势均值为40.07%和35.22%，两指标的变异系数分别为57.56%和57.80%，说明镉胁迫对谷子萌发生长的影响在基因型间差异较大，其中GZ05 在镉胁迫下未发芽，说明其对镉胁迫极为敏感。有研究表明在20～200 mg·L-1镉浓度下，苜蓿(牧歌)种子发芽势显著降低，100 mg·L-1镉浓度下，其发芽率显著降低[11]。同时，研究其萌发后的生长特性也至关重要，种子萌发后其幼苗生长情况一定程度上可反映出对镉胁迫的抗性[20-22]。张盼盼等[23]在200 μmol·L-1镉溶液胁迫下对不同糜子(Panicum miliaceum)品种种子胚芽长、胚根长发芽率等指标测定，筛选出9 份可作为耐镉糜子品种应用于矿区镉污染土壤修复。从幼苗生长状况来看，相对根长的变异系数大于相对芽长的变异系数，说明在同浓度镉胁迫下，根长比芽长更易受到镉胁迫的影响，这与前人研究的镉胁迫对玉米(Zea mays)种子幼苗生长的结果相似[24]。也有研究[25]发现，在盐胁迫处理浓度大于150 mmol.L-1时，对谷子幼苗胚根的抑制作用大于胚芽。另有研究发现镉胁迫对水稻萌发期、辣椒(Capsicum annuum)根长生长抑制效果较为明显[26-27]。这应与种子萌发过程有关，种子吸水膨胀后，胚根先突破种皮接触镉溶液，使胚根在镉积累量、胁迫时间上大于胚芽，从而使谷子根长受镉毒害大于芽长。另外，根系在遭受镉胁迫下会产生逆境乙烯对细胞造成伤害，此伤害也首先发生在根部[24]。

为了更好地、简便地、全面地开展谷子耐镉性的评价，本研究利用主成分分析、聚类分析、隶属函数法相结合的方法对谷子种质的耐镉性进行综合评价。有研究利用主成分分析、聚类分析、隶属函数法对花生萌发期的各个指标进行综合评价及耐盐种质的筛选，筛选出6 份耐盐性强的种质[28]。通过主成分分析将耐镉性指标提取出3 个主成分，累计贡献率达89.81%，可代表原始指标携带的绝大部分信息，为谷子种质资源筛选提供有利依据。采用聚类分析和隶属函数分析相结合的方法，一方面确定了58 份谷子的耐镉特性分为耐镉型品种(占比20.7%)、中间型品种(占比22.4%)和镉敏感型品种(占比56.9%)，另一方面筛选获得了8 份耐镉种质(相对发芽率、相对发芽势≥ 60%)。

本研究通过对58 份主要种植区的谷子种质资源进行耐镉性性鉴定试验，初步筛选获得多份耐镉种质，可应用于镉污染土壤的修复治理，但对其籽粒积累镉的特性还有待进一步研究。