基于GC-MS技术和网络药理学方法探讨那如-3味丸治疗类风湿性关节炎的作用机制

额尼日勒,廖翠平,高 雅,图 雅

(1.内蒙古民族大学蒙医药学院,内蒙古 通辽 028000;2. 中国中医科学院医学实验中心,北京 100700;3.中国中医科学院中医药发展研究中心, 北京 100700)

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病。RA病的特征是多关节、对称性、侵袭性的关节炎,晚期多畸形、残疾,是造成我国人群丧失劳动力和残疾的主药病因之一。可累及心、肺、肾等器官损伤[1]。RA发病率在0.35%左右,高发年龄段为39～59岁。该病女性的发病率要高于男性,女患者多以气血亏损为证[1-3]。

蒙药那如-3味丸由金色诃子、荜茇、草乌(制)组成,味苦、性温、气香,本方出自《至高要方》,异名为“纳如苏木珠日”,中华人民共和国卫生部药品标准(蒙药分册)[4]中也有关那如-3味丸的记载,以功能组方为温性,治疗类风湿性关节炎的良方,临床效果佳。蒙医临床中,类风湿性关节炎也称为“协日乌素症”。

“协日乌素症”也称为“黄水症”,是蒙医分类疾病的“六基症”之一[5]。从蒙医基础理论上可以将“协日乌素症”分为寒性和热性两大类。“协日乌素”与血、希日热合并则形成热性协日乌素病,称为“黑协日乌素病”;与巴达干、赫依之寒合并则形成“寒性协日乌素症”[6]。“协日乌素症”(黄水病)的病质主要为腻、锐、热、湿、泄。关于“协日乌素症”的产生文献中的记录是这样记载的:当人们的一日三餐通过胃加工,将营养精华输送到肝,然后演变成血,血的精华输送到心脏,而血的糟粨到胆囊演变成胆汁,胆汁的精华演变成“协日乌素”[7]。 治疗“协日乌素”症需在调理“赫依”、“希拉”、“巴达干”三根的基础上,使用多为温平药味的方剂来治疗,达到扶胃,燥“协日乌素”并清热或祛寒[2]。由于四个“亚如门德格”——“饮食、起居、时节及其他因素”的影响,上述任何一个或几个因素失去正常状态及相互之间的平衡关系,都会导致“协日乌素症”发病[8]。饮食方面:食如过多的刺激性的食物,例如鱼肉、动物内脏、不易消化、生冷、容易导致过敏的食物“《月光医经》将类风湿关节炎归属于寒性病或寒症,培补养血治疗[8]。《蒙医内科学》(1976年)在托列病的讨论中,提到“该病多见于女性和中青年人群,以手指关节、腕关节等小关节对称性受累为特点”等临床表现[8]。蒙医认为类风湿性关节炎是协日乌素偏盛、偏衰和功能紊乱而导致病变,并损及全身关节而引起的急性发病或慢性经过的一种疾病[9]。并认为类风湿性关节炎的主要发病机制是由于协日乌素增盛,与巴达干黏液和血液相搏,凝聚于关节内而阻碍气血运行所致[3]。机体的各个组织器官都有可能发生“协日乌素症”,包括了超敏反应性疾病、自身免疫性疾病等多种非感染性炎性疾病,也包括部分感染性疾病的中后期病变[9]。治疗“协日乌素症”的药物以辛、苦为主,以寒、钝、轻、糙的药味性能居多,药效以钝、燥、轻为主。苦味含寒、钝性能。能克制“协日”热锐之主质,以达消黏、解毒、调解“赫依”、“希日”、“巴达干”三根之能。

蒙医临床上治疗类风湿性关节炎的常用药物有嘎日迪五味丸、文冠木十味汤(森等-10音汤)、驴血二十五味丸(额勒吉根·齐素-25)、苦参三味汤(道格勒·额布苏-3音汤)等[10]。

因此本研究采用GC-MS方法对那如-3味丸挥发油成分进行分析,并应用网络药理学预测其治疗类风湿性关节的活性成分和作用靶点,为阐明那如-3味丸预防或治疗类风湿性关节炎的药效物质及作用机制提供数据支撑。

1 材料

1.1 药材

蒙药那如-3味丸购买内蒙古通辽附属医院。

1.2 仪器与试剂

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司);XS105DU型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);FA2204B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);水为娃哈哈纯净水;环己烷(天津大茂化学试剂厂,批号20201010)。

1.3 数据库及软件

中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,https://tcmspw.com/index.php);Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/);PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);UniProt数据库(https://www.uniprot.org/);在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,http://www.omim.org/);KEGG数据库(http://www.kegg.jp/);GeneCards数据库(https://www.genecards.org/);DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/);imageGP平台(http://www.ehbio.com/ImageGP/);蛋白结构数据库(PDB,http://www.rcsb.org/);Cytoscape 3.9.0软件和Discovery Studio 2019软件。

2 方法

2.1 那如-3味丸挥发油的提取

取那如-3味丸1.0 kg,置于10000mL圆底烧瓶,加入蒸馏水10L连接挥发油测定器与冷凝管。置电热套中缓慢加热至沸,并保持微沸约6 h,至测定器中油量不再增加,停止加热,放置片刻,收集那如三味丸,得淡黄色透明的油状液体,取那如三味丸丸挥发油100μL加环己烷定容至1 mL量瓶,经0.45μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。

2.2 GC-MS分析

2.2.1色谱条件

HP-5MS色谱柱(0.25mm×30mm,0.25μm)。初始温度为50℃,以16℃·min-1升温至130℃,以1℃·min-1升温至135℃,保持5min;以3℃·1min-1升温至150℃,保持3min;再以5℃·min-1升温至210℃。分流比10:1,进样体积0.4μL,载气为He,载气量1.0mL·min-1。

2.2.2质谱条件

EI检测器,电离电压70eV,离子源温度230℃,传输线温度260℃,四极杆温度150℃。扫描质量范围m/z50～500,溶剂延迟1.0min。

2.3 那如-3味丸挥发油化学成分的鉴定

经GC-MS测那如-3味丸挥发油,得到样品的总离子流图。通过检索比对NIST数据库,鉴定那如-3味丸挥发油样品中的化学成分,并计算各化学成分的含量。

2.4 基于“活性成分-靶点-通路”的网络药理学分析

2.4.1那如-3味丸成分选择及其作用靶点预测

中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/index.php)和SwissTargetPredicition数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/),分别输入那如-3味丸的有效成分,以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和药物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18为条件筛选,得到各药的活性成分。并通过pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找Canonical SMILES、InChIKey和CAS号为后续工作做准备。

2.4.2治疗类风湿性关节炎疾病靶点的搜集

以“Rheumatoid Arthritis,RA”为关键词,检索3个疾病靶点数据库(OMIM、GeneCards、KEGG),以相关性得分(relevance score)>1为标准,得到类风湿性关节炎相关的作用靶点。通过Uniport数据库将靶点蛋白信息转化为Uniport ID,去除重复靶点基因,利用Venny数据库取那如-3味丸的挥发油的活性成分靶点与RA疾病靶点交集,获得那如-3味丸的作用靶点。

2.4.3生物通路富集分析

将“2.4.2”搜集到的潜在靶点输入DAVID数据库,选择物种为“Homo Sapiens”,进行GO注释分析,其中GO分析包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、及细胞组分(cellular component,DC)。保存其结果,并通过imageGP平台对结果可视化。选取有统计学意义(P<0.05)的所有通路。根据相关文献筛选得到直接或间接与类风湿相关的通路。

2.4.4“活性成分-靶点-通路”网络构建与分析

将那如-3味丸的成分、类风湿性关节炎的靶点数据导入Cytoscape 3.9.0软件,构建那如-3味丸治疗类风湿性关节炎的“活性成分-靶点-通路”网络。利用“Network Analysis”功能计算网络拓扑参数,导出介度值、中心度值、度值等参数,度值>平均值的成分可能是那如-3味丸治疗类风湿性关节炎的潜在活性成分。

2.4.5分子对接

根据网络的拓扑分析选取成分中degree较大且含量较高的12个那如-3味丸的主要成分依次与10个核心治疗靶点对接,在PubChem数据库下载活性成分的3D结构,在PDB数据库下载靶点的蛋白结构,采用Discovery Studio2019软件进行分子结构常规预处理,去除水分子,加氢后进行力场优化。导入成分配体选择LibDock对接模式,记录受体与配体的对接分数。

3 结果

3.1 那如-3味丸挥发油化学成分的鉴定

使用水蒸气蒸馏法提取那如-3味丸干燥心材的挥发油,通过GC-MS对挥发油进行分析,其总离子流色谱图(TIC)见图1。通过检索比对NIST数据库,共分离鉴定出那如-3味丸样品中56中化学成分,结果见表1。

表1 那如-3味丸挥发油中化学成分的气质鉴定

图1 那如-3味丸丸挥发油气质分析的TIC

3.2 靶点预测

通过中药系统药理学数据库和分析平台;SwissTargetPredicition数据库预测得到630个成分靶点,利用OMIM、GeneCards 数据库查询类风湿疾病的相关靶点信息,得到2693个疾病靶点。

3.3 相关靶点的GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能注释是通过BP、MF、 CC对基因进行注释和分类(图2A～C)。在BP中信号传导,蛋白质磷酸化占比例较高;在CC中细胞膜、细胞质的占比例较高;在MF中蛋白结合、ATP结合较高。为了进一步确定靶点的生物能,进行KEGG通路分析,取有统计学意义的(P<0.05)的通路,根据文献筛选得到16个类风湿相关的通路,如PI3K-Akt信号、MAPK信号通路和Ras信号通路等,见图2D。

A.BP;B.CC;C.MF;D.KEGG图2 那如-3味丸治疗类风湿性关节炎相关靶蛋白的GO注释功能富集分析及KEGG通路分析

3.4 “活性成分-靶点-通路”网络分析

在输出的网络中,以不同颜色的节点表示活性成分、靶点及作用通路,红色菱形节点代表活性成分,蓝色菱形节点代表作用靶点,而蓝色方形节点代表作用通路,见图3。对网络进行拓扑分析,节点大小与连接度(degree)呈正相关,以节点中介中心性大于中位数0.006,节点紧密度大于中位数0.353,degree大于2倍中位数6,筛选得到前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase 2)、受体激酶插入域(Kinase insert Domain Receptor)等10个核心靶点,见表2。对网络中那如-3味丸的53个活性成分根据degree排序,其中degree大于2倍中位数6且含量较高(峰面积百分比大于1)的活性成分为A-曲乳酰胺、乙酰丁香酚等,见表3。对网络中9个通路中degree较高的通路为PI3K-Akt信号、MAPK信号通路和Ras信号通路等,见表4。

表2 那如-3味丸丸治疗偏头痛的核心靶点

表3 那如-3味丸治疗类风湿性关节炎相关成分的网络参数

表4 那如-3味丸调控的类风湿性关节炎关信号通路

图3 那如-3味丸治疗类风湿性关节炎的“活性成分-靶点-通路”网络注:方块为核心靶点,圆圈为活性成分成分,菱形为关键通路

3.5 分子对接结合

选取“活性成分-靶点-通路”网络中degree值较大且含量较高的11个主要成分和10个核心靶点进行分子对接,对接分数见表5。结果表明反式戊烯醇乙酸酯 、A-曲乳酰胺可与靶点JAK2发生相互作用且对接分数较高;二氯甲烷可与7个核心靶点发生较高的对接,则血小板衍生生长因子受体β、胞内磷脂酰肌醇激酶和前列腺素内过氧化物合酶靶点对任一成分没有对接,其推测那如-3味丸挥发油成分主要通过上述7个靶点发挥着预防或治疗类风湿性关节炎的作用。选取打分最高的成分与靶点进行分析,其对接结果见图4。结果表明反式戊烯醇乙酸酯与JAK2发生相互作用。

表5 那如-3味丸活性成分与关键靶点蛋白的对接打分

图4 反式戊烯醇乙酸酯与JAK2的分子对接

4 讨论

网络药理学是基于系统生物学理论,通过“多成分-多靶点-多途径” 构建多层次的网络,用于探索疾病与药物之间的相关性,为预测药物作用机制的新策略[11]。运用网络药理学的方法初步预测了那如-3味丸挥发油类成分治疗类风湿性关节炎的作用机制。为进一步探讨那如-3味丸挥发油治疗类风湿性关节炎的作用机制,本研究构建“成分-靶点-疾病”网络筛选其可能的作用靶点,得到那如-3味丸挥发油治疗类风湿性关节炎的10个核心基因为PTGS2、JAK2、MAPK1、AKT1、PIK3CD、MAKP8、JAK1、IKBKB、PDGFRB。PTGS2又称环氧合酶2(COX-2),是一种跟炎症反应相关的酶,在细胞中可被促炎细胞因子和生长因子等高度诱导,从而参与炎症反应、细胞增殖、细胞凋亡等多种病理过程。非甾体抗炎药可通过抑制COX-2,阻止前列腺素的合成达到抗炎解热镇痛的作用[12-13]。JAK1、JAK2是JAK 蛋白酪氨酸激酶家族的成员,JAK1能够对细胞因子IL-2、IL-6、IL-10进行应答,JAK2基因的突变可导致真性红细胞增多增,特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化。研究表明,JAK2已成为治疗和预防类风湿性关节炎发生的确切靶点[14]。MAPK1、MAPK8 是MAPK家族成员,在控制炎症反应和免疫反应的诱导和调节中具有重要作用[15]。MAPK1 在 MAPK/ERK 级联中起着重要作用,介导着细胞生长、黏附、存活和分化等多种生物学功能。AKT1 作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一,研究表明AKT1与自噬性死亡有关[16]。IKBKB基因病理性突变会引起一种免疫表型特殊的联合免疫缺陷病[17]。

对关键靶点进行KEGG通路富集分析探究其信号通路中的作用,结果发现那如-3味丸可能通过调控PI3K-ATK、MAKP、RAS、Clacium、PD-L1、JAK-STAT、FoxO、VEGF、mTOR、TNF信号通路等挥发抗类风湿性关节炎的作用。PI3K-ATK信号通路与类风湿性关节炎存在一定关联性。PI3K-ATK信号通路被认为是成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖与凋亡失衡发生的桥梁,并且被认为作为媒介介导RA滑膜炎的发展[18]。MAPK信号通路在类风湿性关节中发挥着重要作用,此信号通路的过度活化与滑膜组织炎性增生与其关节软骨组织破坏密切相关,一直以来被认为是用以治疗类风湿性的前途靶点[19-20]。RAS信号通路作为类风湿性关节炎易敏感点,在类风湿性关节发生、发展过程中意义重大[21]。RAS信号通路的激活介导了类风湿性关节炎的FLS细胞的异常激活及关节骨及软骨的破坏侵蚀。Ras/Raf1信号通路在类风湿关节炎中表达上调,并促进类风湿关节的进展[22]。研究表明,抑制RAS信号通路的活化有助于缓解类风湿性关节炎的骨破坏,可改善类风湿性关节炎的病情[21]。PD-L1信号通路是机体免疫系统的强大调节剂,可通过抑制次信号通路活化T细胞的增殖和分化,从而阻止自身免疫性疾病的发生。PD-L1在类风湿性关节炎等免疫性疾病中表达下调,可以作为靶点的免疫治疗可缓解自身免疫的炎症状态。为治疗免疫性疾病的防御与治疗提供新的策略[23]。JAK-STAT是多种细胞的生长、活化、分化、凋亡及其功能发挥过程中重要的信号通路[24]。研究表明[25],JAK和STAT1、SOCS3在正常人或关节炎病人滑膜中表达很少表达。在类风湿性关节炎患者滑膜组织中表达较高。可经过抑制此信号通路,在临床上为患者提供新的治疗方案。VEGF是一种极为重要的促血管生成因子,可以与滑膜血管内皮上的受体结合,促进滑膜血管的新生,增加血管通透性和炎性因子的释放[26]。文献表明,类风湿性关节炎局部组织PI3K/AKT/mTOR通路被激活,使细胞维持稳定的功能下降,细胞凋亡增加而使结构与功能受到破坏,抑制PI3K/AKT/mTOR通路可有效改善类风湿性关节炎症状[27]。TNF可以激活免疫细胞和内皮细胞,导致炎症介质的释放,如白细胞介质、血小板活化因子等。并且调节细胞因子的产生和分泌,从而影响免疫细胞的功能和免疫反应。本文筛选得到的通路和文献报道的类风湿重要通路较为一致。为深入阐释那如-3味丸挥发油治疗类风湿性关节炎作用机制提供依据。

综上所述,本研究基于GC-MS技术定性表征那如-3味丸挥发油的化学成分,并结合网络药理学与分子对接筛选及验证,其初步探讨了那如-3味丸挥发油治疗类风湿性关节炎的潜在作用机制,为进一步阐明那如-3味丸的治疗类风湿性关节炎机制提供了一定的研究方向和数据支持。