lncRNA KCNQ1OT1通过miR-499a-5p/TXNIP调控缺氧心肌细胞活性和凋亡的机制

樊娜 刘鑫 廖若含

(四川省医学科学院·四川省人民医院心血管超声及心功能科,四川 成都 610000)

心血管疾病是威胁人类生命健康的主要杀手之一,心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭及动脉粥样硬化等均属于心血管相关疾病,且均与心肌细胞损伤有关,其中心肌细胞氧化应激及细胞凋亡是其损伤的重要原因,抑制心肌细胞损伤是治疗心血管疾病的重要途径〔1～3〕。研究发现长链非编码NRA(lncRNA)可通过氧化应激等信号通路及细胞凋亡调控缺血性心肌病的发生和发展,具有作为心血管疾病治疗靶点的潜力〔4〕。KCNQ1重叠转录物(KCNQ1OT)1过表达促进了阿霉素刺激的心肌细胞系HL-1的凋亡〔5〕。敲低KCNQ1OT1可以通过调节miR-2054/蛋白激酶B(AKT)3轴来减轻心脏肥大〔6〕。急性心肌梗死中,抑制KCNQ1OT1保护了心肌细胞免受缺氧触发的细胞凋亡〔7〕,说明KCNQ1OT1与心血管疾病的进展密切相关。研究报道大鼠梗死心肌中miR-499-5p表达量下降,miR-499-5p高表达可靶向Sox6抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡并改善心功能〔8〕。miR-499a-5p可通过靶向CD38减轻缺氧/复氧引起的心肌细胞损伤〔9〕。据报道,硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)与细胞氧化应激、细胞凋亡和炎症密切相关,心肌缺血/再灌损伤时TXNIP表达水平升高并增加心肌自噬〔10〕。厚朴酚通过抑制TXNIP介导的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3炎性体活化来拮抗阿霉素诱导的心肌细胞衰老〔11〕。本实验通过在线软件预测发现KCNQ1OT1与miR-499-5p有结合位点,miR-499-5p与TXNIP有结合位点。然而KCNQ1OT1、miR-499-5p与TXNIP之间的关系及lncRNA KCNQ1OT1是否通过miR-499a-5p/TXNIP调控缺氧心肌细胞损伤还尚未可知。因此,本实验旨在研究lncRNA KCNQ1OT1是否通过miR-499a-5p/TXNIP调控缺氧心肌细胞损伤。

1 材料与方法

1.1主要试剂材料 RNA提取试剂盒、实验所用抗体购自上海圻明生物;心肌细胞H9C2购自美国ATCC;PhyScriptTM2×SYBR Green PCR Mastermix、蛋白提取试剂盒、MTT试剂购自飞净科研公司;DMEM培养基、Trizol试剂购自上海酶研生物;凋亡检测试剂、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂购自上海翌圣科技;丙二醛(MDA)测定试剂购自美国Abcam公司。

1.2细胞处理与分组 心肌细胞H9C2用DMEM培养基培养,分为心肌细胞缺氧预处理组(HPC)、对照(NC)组;HPC组心肌细胞先接种于低糖(5 mmol/L)且无血清DMEM培养基,置于缺氧(95% N2+5% CO2)环境的培养箱中缺氧处理12 h,随后更换含10%胎牛血清的高糖(25 mmol/L)DMEM 培养液,于5% CO2、95% O2环境的培养箱中处理24 h;对照组细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液中正常培养。将si-NC、si-lncRNA KCNQ1OT1、miR-NC、miR-499a-5p、si-TXNIP转染至H9C2细胞后进行缺氧处理,记为si-NC+HPC组、si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组、miR-NC+HPC组、miR-499a-5p+HPC组、si-TXNIP+HPC组;将pcDNA-NC、pcDNA-TXNIP 分别与si-lncRNA KCNQ1OT1共转染至H9C2细胞后进行缺氧处理,记为pcDNA-NC+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组、pcDNA-TXNIP+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p和TXNIP mRNA的表达水平 用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA;反转录成cDNA,按照试剂盒说明进行PCR,相对表达量用2-△△Ct法计算。以GAPDH和U6为内参,引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列(5′-3′):lncRNA KCNQ1OT1上游:ACTCACTCACTCACTCACT,下游CTGGCTCCTTCTATCACATT;miR-499a-5p上游GCCCTGTCCCCTGTGTGCCTT,下游AAACATCACTGCAAGTCTT;TXNIP上游AGTGATTGGCAGCAGGTC,下游GGTGTCTGGGATGTTTAGG;GAPDH上游ACTCCACTCACGGCAAATTC,下游TCTCCATGGTGGTGAAGACA;U6上游CGCTTCGGC AGCACATATACTA,下游CGCTTCACGAATTTGC-GTGTCA。

1.4Western印迹 提取各组细胞总蛋白,取60 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),经电转将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)上;用5%脱脂牛奶室温封闭2 h,分别加入TXNIP、细胞周期素(Cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3相应的一抗,4 ℃孵育过夜,再加入二抗室温孵育2 h,曝光显影,定影,用Quantity One分析蛋白条带的灰度值,以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

1.5MTT 各组细胞培养48 h后每孔加入20 μl的MTT溶液,孵育4 h,再加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO),振荡反应10 min,用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(A)值。

1.6流式细胞术 收集各组细胞,用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次,加入500 μl的结合缓冲液,先加入10 μl的膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC),再加入5 μl的碘化丙啶(PI),混匀后避光孵育10 min;用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7MDA含量和SOD活性分析 细胞培养48 h后收集各组细胞,按试剂盒说明书进行操作。

1.8双荧光素酶报告实验 构建含有miR-499a-5p结合位点的lncRNA KCNQ1OT1和TXNIP的野生型和突变型荧光素酶载体,将其分别与miR-NC和miR-499a-5p共转染至心肌细胞中,按照试剂盒说明检测荧光素酶活性。

将pcDNA-NC、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1分别转染至心肌细胞中,pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1分别与miR-NC、miR-499a-5p共转染至心肌细胞中,RT-qPCR检测lncRNA KCNQ1OT1和miR-499a-5p表达水平,Western印迹检测TXNIP蛋白表达水平。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1两组心肌细胞H9C2中lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p、TXNIP表达 与NC组比较,HPC组心肌细胞H9C2中lncRNA KCNQ1OT1表达水平显著升高,miR-499a-5p表达水平显著降低,TXNIP mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图1、表1。

表1 两组心肌细胞H9C2中lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p、TNXIP表达

1～6:NC组、HPC组、pcDNA-NC组、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1组、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-NC组、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-499a-5p组

2.2下调lncRNA KCNQ1OT1抑制HPC组心肌细胞H9C2凋亡、增加细胞活性、抑制氧化应激 与NC组比较,HPC组心肌细胞H9C2中CyclinD1表达水平、细胞活性降低,Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量升高,SOD活性降低,差异有统计学意义(P<0.05);与si-NC+HPC组比较,si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组心肌细胞H9C2中CyclinD1表达、细胞活性升高,Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量降低,SOD活性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2、图3。

表2 下调lncRNA KCNQ1OT1抑制HPC组心肌细胞H9C2凋亡、增加细胞活性、抑制氧化应激

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

1～6:NC组,HPC组,si-NC+HPC组、si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组、miR-NC+HPC组、miR-499a-5p+HPC组

2.3miR-499a-5p抑制HPC组心肌细胞H9C2凋亡,增加细胞活性,抑制氧化应激 与miR-NC+HPC组比较,miR-499a-5p+HPC组miR-499a-5p、CyclinD1表达水平、细胞活性、SOD活性均显著升高(P<0.05),Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量均显著降低(P<0.05)。见图2、图3、表3。

表3 miR-499a-5p抑制HPC组心肌细胞H9C2凋亡,增加细胞活性,抑制氧化应激

2.4下调TXNIP抑制HPC组心肌细胞H9C2凋亡,增加细胞活性,抑制氧化应激 与si-NC+HPC组比较,si-TXNIP+HPC组TXNIP、Cleaved caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量均显著降低,CyclinD1表达水平、细胞活性、SOD活性均显著升高(P<0.05)。见图2、图4、表4。

表4 下调TXNIP抑制HPC组心肌细胞H9C2凋亡,增加细胞活性,抑制氧化应激

1～4:si-NC+HPC组、si-TNXIP+HPC组、pcDNA-NC-si-lncRNA KCNQ1OTHHPC组、pcDNA-TXNIP+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组

2.5lncRNA KCNQ1OT1通过靶向miR-499a-5p调控TXNIP表达 Starbase在线软件预测显示,lncRNA KCNQ1OT1和miR-499a-5p及miR-499a-5p和TXNIP有结合位点(图5)。双荧光素酶报告实验结果显示,lncRNA KCNQ1OT1-WT及TXNIP-WT与miR-499a-5p共转染的细胞荧光素酶活性低于lncRNA KCNQ1OT1-WT及TXNIP-WT与miR-NC共转染的细胞(P<0.05),而lncRNA KCNQ1OT1-MUT及TXNIP-MUT与miR-499a-5p或miR-NC共转染后的细胞荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)。见表5。与pcDNA-NC组比较,pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1组lncRNA KCNQ1OT1和TXNIP表达水平显著升高,miR-499a-5p表达水平显著降低(P<0.05);与pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-NC组比较,pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-499a-5p组lncRNA KCNQ1OT1和TXNIP表达水平显著降低,miR-499a-5p表达水平显著升高(P<0.05)。见图1、表6。

表5 荧光素酶活性分析

表6 各组lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p和TXNIP的相对表达

(A)miR-499a-5p和TXNIP(B)结合进行预测

2.6TXNIP可以逆转lncRNA KCNQ1OT1下调对HPC组心肌细胞H9C2凋亡,细胞活性和氧化应激的影响 与pcDNA-NC+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组比较,pcDNA-TXNIP+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组TXNIP、Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量均显著升高,CyclinD1表达水平、细胞活性、SOD活性均显著降低(P<0.05)。见图2、图4、表7。

表7 TXNIP可以逆转lncRNA KCNQ1OT1下调对HPC组心肌细胞H9C2凋亡,细胞活性和氧化应激的影响

3 讨 论

本实验结果显示,缺氧诱导的心肌细胞中lncRNA KCNQ1OT1表达水平升高,与相关研究〔12〕结果相似,KCNQ1OT1在心血管相关疾病及细胞模型中高表达。KCNQ1OT1可以通过与miR-204-5p结合来促进LGALS3表达,从而加剧小鼠心肌缺血/再灌注损伤〔13〕。KCNQ1OT1敲低显著改善了氧葡萄糖剥夺和再灌注诱导的PC12细胞炎症,氧化应激和细胞凋亡〔14〕,说明KCNQ1OT1不仅影响细胞凋亡,还与氧化应激反应相关。氧化应激指氧化剂产生与抗氧化防御之间的失衡,其发生与氧自由基异常积累有关,内源性和外源性因素都可以诱导氧化应激〔15〕。MDA是脂质过氧化的产物,其含量高低可反映氧自由基对组织细胞膜结构的损害程度;SOD是抗氧化酶,可清除体内多余的氧自由基,抑制氧化应激的发生〔16,17〕。本实验结果说明,缺氧诱导了心肌细胞氧化损伤,下调KCNQ1OT1可抑制氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激。研究报道mR-499可抑制心肌细胞凋亡及损伤〔18,19〕。miR-499a-5p过表达促进了人骨髓来源的间充质干细胞向心肌细胞分化〔20〕。本实验结果显示,缺氧诱导的心肌细胞中miR-499a-5p表达水平降低;上调miR-499a-5p可降低缺氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激;miR-499a-5p具有抗心肌细胞损伤的作用,且其可受KCNQ1OT1调控。

七氟烷预处理可通过调节TXNIP抑制氧-葡萄糖剥夺诱导的心肌细胞氧化损伤〔21〕。miR-148a通过抑制TXNIP和Toll样受体(TLR)4/NF-κB/NLRP3炎性体信号通路来减轻心肌缺血/再灌注损伤〔22〕。本实验结果显示,缺氧诱导的心肌细胞中TXNIP mRNA和蛋白表达水平升高;下调TXNIP可降低缺氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激,下调TXNIP可抑制心肌细胞损伤;miR-499a-5p调控TXNIP表达,且KCNQ1OT1靶向调控miR-499a-5p;过表达KCNQ1OT1 后,miR-499a-5p表达水平降低,TXNIP表达水平升高;过表达TXNIP可以逆转lncRNA KCNQ1OT1下调对缺氧诱导的心肌细胞H9C2的影响,提示KCNQ1OT1可能通过miR-499a-5p调控TXNIP的表达。

综上,下调lncRNA KCNQ1OT1可能通过miR-499a-5p/TXNIP轴抑制缺氧诱导心肌细胞凋亡和氧化应激,促进细胞存活。