基于microRNA表达谱变化探讨“秩边透水道”针法治疗对子宫内膜异位症患者的疗效

马文娟, 苏 琦, 陈 静, 宣婉丽

(1西北妇女儿童医院药剂科, 西安 710061, 2西安医学院第三附属医院妇产科, 西安 710021)

子宫内膜异位症(Endometriosis,EMS)是一种女性常见妇科疾病,以子宫内膜生长于宫腔以外部位为特征[1]。25～45岁为EMS高发人群,轻者可引起痛经、月经失调、慢性盆腔痛等,病情严重者可影响其生育功能,导致不孕,进而影响生活质量[2]。药物、手术为EMS西医治疗的常见手段,但存在易复发、副作用多、费用高等缺陷[3]。EMS属于中医“癥瘕”、“痛经”范畴,瘀血为其基本病理因素,冲任二脉遭瘀血阻滞,气血失于畅达,长年累积而发为EMS[4]。近年来中医药因其效果显著在EMS治疗中受到高度关注,其中针灸疗法被广泛认可[5]。“秩边透水道”针法作为芒针疗法中的独特针刺手段之一,根据特定操作手法从秩边穴透向水道穴深刺,能够缓解疼痛,改善子宫血液微循环,并在EMS动物模型中已显示出良好疗效[6]。微小核糖核酸(microRNA,miR)为小片段的非编码类RNA,在EMS子宫内膜组织中呈异常表达,与EMS发生、发展及其引起的不孕等关系密切[7]。本研究选取EMS患者为研究对象,在西医治疗基础上采用“秩边透水道”针法治疗,观察治疗前后视觉模拟量表(Visual simulation scale,VAS)评分、性激素水平、血流动力学指标等指标变化探讨其疗效,并从microRNA表达谱变化角度探索其治疗机制,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料经西北妇女儿童医院伦理委员会批准,选取2019年10月至2022年10月西北妇女儿童医院收治的133例EMS患者,按随机数字表法分为对照组(n=66)与观察组(n=67)。西医诊断标准:西医诊断符合《妇产科学》[8],包括临床诊断、B超诊断、腹腔镜诊断。中医辨证标准:中医诊断符合《实用中医妇科学》[9],辨证为气滞血瘀型:渐进性痛经,经前或经期少腹胀痛或刺痛,乳房胀痛,经色暗、伴黑色血块且块下痛减,腹内有积块且按之坚实不移,患者舌苔暗紫或可见瘀点,脉弦涩。纳入标准:符合EMS诊断标准[8-9];无凝血系统疾病、恶性肿瘤及精神障碍;年龄25～45岁;病历资料完整;受试者依从性、配合度良好;自愿参加研究并签订书面同意。排除标准:心肝肾脑肺功能障碍;合并子宫肌瘤;全身性免疫系统疾病;近90 d应用过激素类药; 妊娠、哺乳期妇女。剔除标准:不符合纳排标准而误纳入本次研究者;发生严重不良事件、并发症和特殊生理变化,不宜继续接受治疗者;依从性差,不能坚持治疗者;入组期间主动退出试验者。研究实行患者盲法(接受何种治疗方法患者自己不知道,仅针刺操作者知晓),由不清楚分组情况的专职评价者对临床疗效和各项指标进行评价;由专职统计人员实施盲法统计分析,以保证结果的真实可靠性。

1.2 方法

1.2.1 治疗方案 对照组患者于月经来潮第1 d口服米非司酮片(规格25 mg×1片,上海新华联制药有限公司,国药准字 H20000629),1次/d,25 mg/次,连续治疗3个月。观察组在对照组基础上应用“秩边透水道”针法治疗,主穴为秩边透水道,配穴为膈俞、太冲、血海、气海、三阴交。操作如下:取俯卧位,皮肤常规消毒,将芒针(0.25 mm×125 mm)从髂后上棘内缘与患者股骨大转子内缘连线的下3/5、上2/5交界处进针,而后由秩边穴透向水道穴深刺,令针感达至人体小腹部为度,捻转法60 s,留针0.5 h。其余穴位常规针刺,局部有酸胀感为宜,留针0.5 h,其间再施行平补平泻手法2次。1次/d,连续治疗3个月。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 临床疗效 治疗3个月后,参考《中药新药临床研究指导原则》[10]评价其疗效。痊愈:盆腔包块、临床症状完全消失;显效:盆腔包块缩小明显,症状基本消失;有效:盆腔包块缩小不明显,症状明显减轻;无效:盆腔包块增大,症状未好转甚至恶化。总有效为痊愈+显效+有效。

1.2.2.2 VAS评分 治疗前和治疗1、2、3个月后,通过VAS量表评估患者痛经程度,0分、<3分、4～6分、7～10分依次表示无痛、能忍受的轻微疼痛、影响睡眠且尚能忍受的疼痛、难以忍受的强烈疼痛[11]。

1.2.2.3 血清FSH、E2、LH、EMAb、CA125水平测定 治疗前和治疗3个月后,收集空腹外周静脉血5 mL,离心(3 500 r/min、15 min),收集血清,血清样本-20℃保存备测。利用ELISA法、赛默飞K3型酶标仪(深圳市南方明源光电仪器有限公司)测定血清卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、抗子宫内膜抗体(Anti endometrial antibody,EMAb)、癌胚抗原125(Carcinoembryonic antigen 125,CAl25)水平,试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司、上海烜雅生物科技有限公司、上海钰博生物科技有限公司、上海广锐生物科技有限公司、上海信裕生物科技有限公司。

1.2.2.4 血流动力学指标 治疗前和治疗3个月后,PF-522型彩色多普勒超声仪(江苏大为医疗有限公司)测定阻力指数(resistance index,RI)以及搏动指数(pulse index,PI)。

1.2.2.5 外周血单个核细胞中miR-141-3p、miR-17-5p、miR-145表达水平 治疗前和治疗3个月后进行测定。分离外周血单个核细胞,应用Trizol试剂盒(北京凯诗源生物科技有限公司)提取细胞总RNA,Thermo超微量紫外分光光度计(济南爱来宝仪器设备有限公司)测RNA浓度、纯度,Takara逆转录试剂盒(上海梵态生物科技有限公司)将总RNA逆转录为cDNA。通过ABI7500定量PCR仪(上海实维实验仪器技术有限公司)检测,反应体系(20 μL):cDNA 1 μL、2×SYBR Green Mix10 μL、去离子水7.4 μL、上下游引物10 μmol/L分别0.8 μL。PCR扩增产物通过2%琼脂糖电泳分离,以2-ΔΔCt法计算miR-141-3p、miR-17-5p、miR-145相对表达量。引物序列如下:miR-141-3p上游5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′及下游5′-TAGGACAGCCAGGCCAGCAACA-3′;miR-17-5p上游5′-TCACCCTGAGATGGGAGC-3′及下游5′-AGCTCTTCCTCCTCCACAT-3′;miR-145上游5′ GCCGCAAAGTGCTTACAGTG 3′及下游5′ TGCAGGGTCCGAGGTAT 3′;内参U6上游5′-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3′及下游5′-GCCGA-TCCACACGGAGTACT-3′。

1.2.2.6 不良反应 包括呼吸、脉搏、体温、血压等生命体征观察,血常规、尿常规、便常规检查,肝、肾功能异常。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较对照组2例依从性差,未按医嘱、治疗方案执行本研究,观察组有3例受到疫情影响而要求自行退出试验,最终共128例完成研究。两组患者一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者临床疗效比较对照组中痊愈8例、显效19例、有效24例、无效13例,观察组中痊愈14例、显效26例、有效20例、无效4例,观察组临床疗效总有效率显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者临床疗效比较/例(%)

2.3 两组患者治疗前后VAS评分比较治疗前,两组患者VAS评分差异无统计学意义(P>0.05);治疗1、2、3个月后,两组患者VAS评分均较治疗前降低(P<0.05),且观察组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。

图1 两组患者治疗前后的VAS评分曲线图

表3 两组患者治疗前后VAS评分比较 分)

2.4 两组患者治疗前后性激素水平比较与治疗前比较,两组患者治疗3个月后FSH、E2、EMAb、CA125、PI、RI、miR-145均降低(P<0.05),LH、miR-141-3p、miR-17-5p均升高(P<0.05),且观察组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组患者治疗前后性激素水平比较

2.5 两组患者治疗前后EMAb和CA125水平比较治疗前,两组患者血清EMAb和CA125水平差异无统计学意义(P>0.05);两组患者治疗3个月后EMAb和CA125均降低(P<0.05),且观察组EMAb和CA125与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 两组患者治疗前后EMAb和CA125水平比较

2.6 两组患者治疗前后血流动力学指标比较治疗前,两组患者PI、RI差异无统计学意义(P>0.05);治疗3个月后,两组患者PI、RI均降低(P<0.05),且观察组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 两组患者治疗前后PI、RI比较

2.7 两组患者治疗前后的EMS相关microRNA表达水平比较两组患者治疗前外周血单个核细胞中miR-141-3p、miR-17-5p、miR-145表达水平差异无统计学意义(P>0.05);治疗3个月后,两组患者治疗后miR-141-3p和miR-17-5p表达水平均升高(P<0.05),miR-145表达水平降低(P<0.05),且观察组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表7。

表7 两组患者治疗前后的EMS相关microRNA表达水平比较

2.8 两组患者安全性分析用药过程中两组患者呼吸、脉搏、体温、血压等生命体征均平稳,血、尿、便常规基本正常,均未见严重不良反应。

3 讨论

中医认为血瘀是EMS基本病理基础,贯穿EMS发生和发展,而血瘀通常与气滞关系密切,气机受阻,血行不畅,而形成瘀血,瘀血停滞下焦,不通则痛,瘀滞日久而形成癥瘕,瘀血内阻冲任胞宫,则难以摄精成孕[12]。针灸属于中医疗法中较为常见的一种,能调畅全身气机,推动气血运行。“秩边透水道”针法是独具特色的中医技术之一,具有疏通经络、活血化瘀、补益肾气、改善局部血液循环、调节内分泌、缓解疼痛之效。研究显示,“秩边透水道”针法治疗对原发性痛经治疗效果显著,可有效改善下腹部阵发性绞痛症状[13-14];“秩边透水道”针法治疗可通过增加大鼠子宫内膜组织Beclin-1与LC3水平以改善EMS症状[15]。

本研究结果显示,观察组临床疗效总有效率显著高于对照组,治疗1、2、3个月后VAS评分显著低于对照组,提示“秩边透水道”针法治疗子宫内膜异位症的临床疗效较佳。EMS是一种激素依赖性疾病,患者FSH、E2、LH常处于异常状态,进一步加重了EMS病情[16]。本研究显示,两组患者治疗后FSH、E2降低,LH升高,且观察组与对照组比较差异有统计学意义,提示“秩边透水道”针法治疗有助于调节患者性激素水平。EMAb是子宫内膜靶向抗体,其水平高低可反映EMS疾病活动度,有助于判断EMS临床转归;CA125是一种膜抗原,通常分布于子宫内膜、腹膜、正常生殖道,其在EMS中表达水平明显上调,并与EMS病情程度呈正相关,是诊断EMS的重要指标[17]。本研究显示,两组患者治疗后EMAb和CA125均降低,且观察组与对照组比较差异有统计学意义,提示“秩边透水道”针法治疗可有效降低患者外周血EMAb和CA125水平。EMS发生后,患者子宫动脉血流灌注受阻,其血流速度变缓,PI、RI增高[18]。本研究显示,两组患者治疗后PI、RI降低,且观察组降低更明显。分析原因如下:秩边穴是“足太阳膀胱经”之重要穴位,针刺该穴可清利下焦、调理气血、疏通经络;水道穴为足阳明胃经腧穴,刺之可起到行气活血、利水调经之效;此外,针刺气海穴可调一身元气,气充则能统摄血液,固摄胞宫;血海穴是脾经所生之血聚集地,刺之可起到活血化瘀、引血归经之效;膈俞穴属足太阳膀胱经,刺之有宽胸理气、活血通脉之功;太冲穴属足厥阴肝经,有调和气血、通络止痛之功;三阴交为足三阴之会穴,是妇科疾病之常用穴位,刺之可发挥培元固本、调和冲任、调理气血、调经止痛作用。此外,用药过程中两组患者均未见严重不良反应,提示该治疗方案安全性较好。

EMS病因复杂,microRNA调控为表观遗传机制中的关键组成部分,在转录后基因表达调控中具有重要作用[19]。多项研究已表明,microRNA与EMS病理过程相关,可调控子宫内膜细胞增生、侵袭、上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)、血管形成、炎症反应等[20-21]。有研究发现,miR-141-3p分子与EMS关系密切,其在EMS中呈低表达;miR-141-3p可靶向抑制转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)活性,抑制EMS子宫内膜间质细胞黏附、侵袭,进而阻止EMS进展[22-23]。有研究显示,外周血miR-17-5p表达水平与EMS患者痛经程度、r-AFS分期均呈负相关;与正常子宫内膜间质细胞相比,在EMS患者子宫内膜间质细胞中miR-17-5p水平明显下调,过表达miR-17-5p可减弱子宫内膜间质细胞增殖活性,并诱导其凋亡[24-25]。既往报道提到,EMS子宫内膜组织中miR-145表达上调,miR-145可通过促进子宫内膜基质细胞EMT过程,促进EMS病情进展[26-27]。本研究结果显示,EMS患者经“秩边透水道”针法治疗+西医治疗后,其外周血单个核细胞中miR-141-3p、miR-17-5p表达水平明显升高,miR-145表达水平明显下降。

综上所述,“秩边透水道”针法治疗子宫内膜异位症患者的疗效较佳,可有效减缓痛经程度,调节性激素及EMAb、CA125水平,改善血流动力学状态,其疗效机制可能与上调miR-141-3p、miR-17-5p及下调miR-145表达水平有关。但本研究样本量有限,未进行长期随访,且未对炎症因子及复发、妊娠情况等进行观察,今后需进一步深入研究。