不同水分含量下黑土硝化反硝化微生物群落结构的变化

丛兢兢，马君玲，李顺和，高 威，鲍雪莲，朱雪峰，解宏图，王连峰*

（1 大连交通大学环境与化学工程学院，辽宁大连 116028；2 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态重点实验室，湖南长沙 410125；3 中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳 110016）

东北黑土区总面积109 万km2，是世界三大黑土带之一，贡献了我国粮食总产量的1/4，被认为是国家粮食安全的“稳压器”和“压舱石”[1-2]。黑土以高有机质含量和高肥力著称，是地球上珍贵的土壤资源。土壤水分是影响黑土氮素累积和转化的重要因素之一。土壤水分的有效性直接影响土壤氧气的扩散过程，以及土壤氧化还原状况和土壤微生物群落结构[3-4]，进而对土壤硝化与反硝化等氮转化关键微生物功能过程造成影响[5]。在当前全球气候变暖的背景下，极端干旱和降雨的频繁发生易导致土壤水分含量的剧烈变化，且东北黑土区处于温带半湿润气候带，土壤湿度容易发生变化[6]。因此，研究不同水分含量下黑土微生物群落结构变化特征与功能响应规律对黑土合理水分管理具有重要意义。

基于通量观测和高通量测序的众多研究表明，土壤水分是影响土壤硝化与反硝化微生物的重要因子[7-8]。土壤反硝化作用过程相关的酶多是在低氧条件下才能被诱导合成并具有活性，因而土壤水分通过影响土壤氧气含量和土壤氧化还原电位间接对反硝化过程产生影响[9]。Qin 等[10]研究发现，高水分含量有利于nosZ 反硝化类群的生长，进而影响N2O 还原。而针对硝化微生物，Moreno-Espíndola等[11]的研究发现，Nitrospirae 同样受土壤水分控制，Nitrosospira一般在湿地土壤环境中具有很好的适应能力[12]。多数研究认为，在低土壤水分含量下以硝化作用为主，而在高土壤水分含量下以反硝化作用为主[13-14]，但是土壤硝化与反硝化作用相对贡献发生明显分异的水分阈值仍有争议。例如，有研究发现，在40% WHC 土壤含水量条件下土壤硝化作用占主导地位，而在110% WHC 土壤含水量条件下硝化作用减弱[15]。但是，也有研究发现，土壤含水量在31%、41%、53%、65%和78% WHC 下土壤反硝化作用均为产生N2O 的主要过程[16]。此外，目前的多数研究主要集中在土壤水分对土壤硝化作用或者土壤反硝化作用等单一过程的影响，而从整体微生物群落水平同时解析土壤硝化与反硝化微生物对土壤水分的响应研究并不多见，且其中的微生物机制尚不清楚。例如，在黑龙江抚远三江湿地保护区，开垦使黑土关键微生物群落包括硝化与反硝化微生物组成发生了显著变化，分析推测土壤含水量可能是决定土壤关键微生物功能差异的重要因素[17]。

田间原位环境气候复杂多变，很难实现土壤水分的精准控制。据此，本研究采用室内微宇宙控制试验，依托长期定位试验平台采集黑土区表层土壤样品，通过调节土壤水分含量模拟土壤不同水分含量梯度，结合实时荧光定量q-PCR 研究土壤硝化与反硝化微生物数量对水分梯度的响应规律，进一步通过高通量测序技术与分析，揭示土壤水分对土壤微生物群落结构的影响规律，为黑土施肥优化和合理水分管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤采自吉林省梨树县大房乡高家村(43°19'N，124°14'E)“中国科学院保护性耕作研发基地”。试验区气候为温带半湿润大陆性季风气候，年平均气温为5.8℃，年降水量为577 mm，降水主要集中在6—8 月。种植模式以玉米连作为主。土壤类型为黑土，壤质黏土。土壤基本理化性质如下：有机碳11.3 g/kg、全氮1.2 g/kg、全磷0.98 g/kg、全钾24.3 g/kg、pH (H2O) 7.1、砂粒24.81%、粉粒47.65%、黏粒27.54%。

1.2 试验设计

通过“蛇形法”采集0—20 cm 耕层土壤，将采集的试验用土翻拌法混合均匀后，尽快运回实验室-20℃保存，试验前将土壤置于阴凉干燥通风的环境下风干至土壤基本保持恒重，并用镊子去除土壤中肉眼可见的植物残体以及大颗粒石子，部分土样过2 mm 筛备用。采用烘干法测定土壤含水量，采用环刀法测定田间最大持水量(Water holding capacity，WHC)。共设置了4 个土壤水分含量处理，分别为40% WHC、60% WHC、80% WHC、100% WHC，每个处理设置3 次重复。

取12 份过2 mm 筛的土壤样品，每份2.5 g，分别置于120 mL 玻璃血清瓶中，记录好对应编号。并把装入到血清瓶中的土壤样本，用针管(或滴管)调节含水率到40% WHC、60% WHC、80% WHC、100% WHC。置于低温培养箱中，调节温度为(25±1)℃，连续培养7 天。培养结束后进行破坏性取样，取足量土壤样品用于DNA 提取并保存于-80℃冰箱，以备q-PCR 定量以及高通量测序的分析。

1.3 土壤DNA 提取和实时荧光定量q-PCR

选用Power Soil ® DNA Isolation Kit 试剂盒，每个样品取0.25 g 土壤样品，按照说明书提取土壤DNA，将提取到的DNA 于1%琼脂糖凝胶中电泳，并在Gel Doc XR +凝胶成像系统中进行检测。

采用SYBRGREEN 法在CFX Connect Real-time PCR Detection System (Bio-Rad)上对功能基因进行定量分析。试剂盒选用宝生物工程 (大连) 有限公司生产的SYBR PremixExTaq™。引物序列及定量PCR反应程序见表1

表1 荧光定量PCR 所需引物及反应条件Table 1 The amplification primers and reaction conditions of quantitative PCR

1.4 16SrRNA 基因Miseq 高通量测序

Miseq 高通量测序使用Illumina 测序仪进行测序，获得环境微生物群落的微生物组成及分类信息，采用PCR 通过加入Taq 序列和adapter 序列修饰的引物515F/907R，对样品微生物DNA 的16S rRNA基因进行扩增。测序原始结果使用RDPpipline 在线分析及Mothur 本地软件进行分析。首先对序列中低质量序列进行剔除，根据标签序列把序列分到每个样品中，然后对每个样品中的DNA 序列去掉标签序列等非目标微生物序列，对优化序列提取非重复序列并去除没有重复的单序列，在97%相似性水平对非重复序列(不含单序列)进行OTU 聚类并去除嵌合体，得到OTU 的代表序列，将优化序列map 至OTU代表序列，选出与代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU 表格，采用RDP classifier 对微生物进行分类。操作分类单元OTU 采用3%的Cutoff，运用Mothur 软件运行对每个样品进行OTU 分析以及代表序列的选择。

1.5 数据统计分析

对细菌16S rRNA 基因可变区V4～5 进行扩增构建PE 文库[18]，样本的测序序列可从中国国家基因库(https://db.cngb.org/cnsa/home，CNSA)获取，登录号为CNX0085253-CNX0085325。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，统计各样本的群落物种组成，在Silva 数据库(http://www.arb-silva.de)中进行比对。美吉生信云平台(https://cloud.majorbio.com/)上进行α-多样性、β-多样性分析，在α-多样性分析中，计算了常规使用的Shannon、Ace、Chao 和Coverage 指标。基于R 语言中Bray_curtis 距离算法进行β-多样性分析中主成分分析PCoA 分析和PERMANOVA 分析。使用维恩图(Venn diagram)计算多个样本中常见和唯一的分类单元(如门和属)的数量。

数据采用Excel 进行分析，数据差异显著性分析采用IBM SPSS Statistics 25 完成，P＜0.05 为差异显著，使用Origin 2018 和Adobe Acrobat Pro DC 进行作图。

2 结果与分析

2.1 土壤水分含量对土壤硝化功能基因丰度的影响

图1 显示，土壤水分含量对硝化微生物基因丰度影响显著。氨氧化古菌AOA 基因拷贝数对高土壤水分含量 (80% WHC 和100% WHC) 与低土壤水分含量 (40% WHC 和60% WHC) 的响应相反，在60% WHC 处理下最低，为5.33×1013copies/g。相较于60% WHC 处理，80% WHC 处理AOA 基因拷贝数增加了94.3%，100% WHC 处理增加了2.13 倍，为11.4×1013copies/g。氨氧化细菌AOB 基因拷贝数在低土壤水分含量条件下与AOA 的基因拷贝数变化趋势相反，60% WHC 处理下较40% WHC 处理增长50.2%，80% WHC 处理下较60% WHC 处理降低23.9%，但AOB 基因拷贝数在高土壤水分含量条件下随土壤水分含量增加而增长，在饱和土壤水分含量条件创造的微氧环境下明显高于其他处理，100% WHC 处理下较80% WHC 处理增长了99.9%，为5.92×1011copies/g。不同土壤水分状况下，AOA 基因拷贝数最高是A O B 基因拷贝数的1 8 2 倍。AOA/AOB 值变化范围为137～327，从60% WHC 处理下的137 增长到80% WHC 处理下的314。上述结果表明，氨氧化古菌对于土壤水分含量的变化十分敏感，并且100% WHC 处理下氨氧化古菌基因拷贝数明显高于氨氧化细菌基因拷贝数，说明土壤氨氧化古菌比氨氧化细菌更加适应于高土壤水分状况。

图1 不同水分含量土壤AOA_amoA 和AOB_amoA 功能基因丰度的变化情况Fig.1 Changes of functional gene abundance of AOA_amoA and AOB_amoA in soil with different moisture content

2.2 土壤水分含量对土壤反硝化功能基因丰度的影响

图2 显示，nirS 和nosZ 的基因丰度在60% WHC处理下较40% WHC 均增长了0.5 倍，高土壤水分含量条件80% WHC 和100% WHC 下基因丰度分别增长了10 和1.6 倍。nirS 的基因拷贝数随土壤水分含量的增加呈增长趋势，低土壤水分含量条件下60% WHC较40% WHC 增长了54.1%，基因丰度变化范围为3.79×109～5.84×109copies/g。高土壤水分含量条件下基因丰度增长极为显著，100% WHC 处理下增长了一个数量级，是80% WHC 处理下基因丰度的10倍，100% WHC 处理下nirS 基因丰度达到最高值为1.45×1011copies/g。说明淹水条件有利于nirS 基因微生物群落生存，其活性强。类似地，nosZ 的基因拷贝数随土壤水分含量增加而增长，低土壤水分含量条件下，40% WHC 处理土壤基因拷贝数为2.29×106copies/g，而在高土壤水分含量条件下，100% WHC处理土壤nosZ 基因丰度显著增长，较80% WHC 处理增长了54.2%，基因丰度为6.01×106copies/g。

图2 不同水分含量土壤nirS 和nosZ 功能基因丰度的变化Fig.2 Changes of nirS and nosZ functional gene abundance in soil with different moisture content

高土壤水分含量条件下，两组基因拷贝数均极显著增长，且100% WHC 处理土壤的微氧环境条件下，两组基因拷贝数都达到最高值，说明其创造的微氧条件更利于反硝化微生物群落的生长增殖。值得注意的是，淹水条件创造的微氧环境有利于氧化亚氮还原酶基因微生物的生存，为氧化亚氮还原为氮气提供了更有利的条件。

2.3 土壤水分状况对土壤微生物物种多样性的影响

由表2 可见，4 组处理的文库覆盖率均达到97%以上。不同处理Alpha 多样性指数情况相近，Shannon指数、Ace 指数和Chao 指数，80% WHC 处理土壤在4 组土壤中均处于最高值，说明80% WHC 处理土壤微生物物种丰富度较高，但80% WHC 处理土壤的物种集中度较低。100% WHC 处理土壤的Shannon 指数和ace 指数均为最低，其物种丰富度相对较低。说明高土壤水分含量处理土壤微生物群落的物种丰富度和多样性较高，而淹水处理土壤微生物群落的多样性较低。

表2 不同水分含量土壤细菌Alpha 多样性指数Table 2 Alpha diversity in bacterial communities of soil with different moisture

2.4 土壤水分状况对土壤微生物物种组间差异的影响

通过Bray_curtis 距离算法，进行属水平上的PCoA 主成分分析，揭示了不同土壤水分含量处理土壤细菌群落结构差异(图3)。结果表明，土壤水分处理之间土壤细菌群落存在显著性差异。4 组处理中，100% WHC 处理与其他3 组处理显著分离，40% WHC和60% WHC 处理相近。

图3 属水平PCoA 图Fig.3 PCoA map at the genus level

通过Bray_curtis 距离算法，在OTU 水平进行PERMANOVA 分析，结果显示F=5.0780，R2= 0.6557，P=0.001，说明组间差异极显著。通过ANOSIM 分析结果显示，R2= 0.9151，P=0.001，说明组间差异显著大于组内差异，不同土壤水分状况微生物群落组成差异显著。

2.5 不同土壤水分状况细菌群落物种组成分析

黑土4 种土壤水分状况下共计检测到了3491 个OTUs，属于29 个门、75 个纲、193 目、343 个科、623 个属、1279 个种。通过图4 可以清晰地看出，4 组处理土壤细菌群落物种的差异，在门水平下，4 组处理共有22 个门，不同处理间重叠分类门的数量为：40% WHC 和80% WHC 为1 个门，40% WHC、60% WHC 和80% WHC 为1 个门，60% WHC、80% WHC 和100% WHC 为2 个门。在属水平下，4组处理共有384 个属，80% WHC 处理的物种特异性高，独有34 个属；100% WHC 物种丰富度低，独有19个属，不同处理间重叠属数量最多的为40% WHC、60% WHC 和80% WHC，有30 个属重叠，而40% WHC处理和80% WHC、100% WHC 重叠属数量最少，仅为11 个，说明淹水状态下微生物的种类会发生显著变化。

图4 微生物群落结构门和属水平韦恩图Fig.4 Venn diagram of microbial community structure at phylum and genus levels

土壤水分状况对土壤微生物门水平的群落组成影响显著。通过图5 可知，在40% WHC 处理下，放线菌门(Actinobacteria，12.1%)、绿弯菌门(Chloroflexi，3.9%)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，3.5%)相对丰度均高于其余3 组土壤水分处理，为优势物种，随着土壤水分含量增加，呈现与土壤水分含量负相关趋势。60% WHC 处理下酸杆菌门(Acidobacteria，23.1%)、浮霉菌门(Planctomycetes，2.9%)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae，2.4%)为优势物种，以60% WHC处理条件为界，在高土壤水分含量条件下随土壤水分含量增加呈现下降趋势。在高土壤水分含量条件下，优势物种为变形菌门(Proteobacteria，57.4%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，21.3%)，相对丰度占比在100% WHC 处理条件下达到最高值，表明相对丰度占比与土壤水分含量呈正相关。在属水平上，低土壤水分含量条件下，RB41(6.4%～6.7%)、硝化螺旋菌属(Nitrospira，1.6%～2.4%)、节杆菌属(Arthrobacter，1.4%～2.9%)为优势物种。高土壤水分含量条件下，100% WHC 处理土壤中根瘤杆菌属(Rhizobacter，10.97%)、黄杆菌属(Flavobacterium，6.7%)、假单胞菌属(Pseudomonas，8.71%)和纤维弧菌属(Cellvibrio，2.93%)占比较高，其中假单胞菌属和根瘤杆菌属在100% WHC 处理下急速增长，较80% WHC 处理增长了6 和10 倍。

图5 微生物群落结构优势门和属堆积柱状图Fig.5 Predominant phylotypes of predominant microbial community at phylum and genus levels under different water contents

2.6 土壤水分状况与关键微生物群落相关性分析

本研研究中，共发现29 个门，与土壤含水量呈正相关趋势的有6 个门，分别为Proteobacteria、Bacteroidetes、unclassified_k_norank_d_Bacteria、Firmicutes、Patescibacteria、BRC1，其中，变形菌门(Proteobacteria，R2=0.8490)和拟杆菌门(Bacteroidetes，R2=0.6874)分别与土壤含水量呈极显著正相关和正相关关系(图6)。在属水平上，根瘤杆菌属(Rhizobacter，R2=0.6261)和假单胞菌属(Pseudomonas，R2=0.6917)与土壤水分含量呈极显著正相关关系，黄杆菌属(Flavobacterium，R2=0.5260)与土壤水分含量呈正相关关系(图7)。与土壤含水量呈负相关的微生物门有23 个，其中放线菌门(Actinobacteria，R2=0.8108)和酸杆菌门(Acidobacteria，R2=0.7685)分别与土壤水分含量呈显著负相关和极显著负相关。RB41(R2=0.7150)与土壤水分含量呈极显著负相关关系，而硝化螺旋菌属(Nitrospira，R2=0.2177)呈负相关关系。

图6 微生物群落优势门线性拟合分析Fig.6 Linear fitting analysis of predominant phylotypes at phylum level of microbial community

图7 微生物群落优势属线性拟合分析Fig.7 Linear fitting analysis of predominant phylotypes at genus level of microbial community

3 讨论

3.1 土壤水分状况对硝化/反硝化微生物数量基因丰度的影响

土壤水分含量是影响土壤硝化/反硝化微生物群落构建的重要因素之一[13,19]，土壤水分含量不同影响土壤的通气环境，从而影响土壤的厌氧以及好氧环境。硝化作用由AOA、AOB 驱动，是氮素循环的中心过程[20]。在本研究中，AOA_amoA 和AOB_amoA的基因丰度在低土壤水分含量条件下分别随土壤水分含量增加呈下降和增长趋势，以60% WHC 土壤含水率为界，在高土壤水分含量条件下基因丰度均随土壤水分含量增加而上升，淹水条件处理下基因丰度达到峰值，AOA/AOB 的基因丰度比值，在高土壤水分含量条件下变化区间为205～314，说明氨氧化古菌和氨氧化细菌对低氧环境有一定的适应能力，并且在淹水条件下氨氧化古菌占据主导地位。Dai等[21]的研究中，土壤进行淹水培养150 天后，AOA/AOB 基因丰度比值从0 天的20.8 增长到150 天的52.9，AOA 在淹水条件下占主导地位，Santoro 等[22]研究中也得到与其相似的结果，并且就不同的土壤类型而言，在稻田土壤的研究[23]中也得出了相似的结论。此外，有研究报道，对于江苏水稻土进行淹水处理7 天，显著增加了AOB 的基因丰度，而AOA微生物群落和丰度无明显变化[24]。但在本研究中，低土壤水分含量到高土壤水分含量AOA 的基因丰度变化远高于AOB，氨氧化古菌对于土壤水分条件的响应比氨氧化细菌更灵敏，这可能是土壤类型不同，使氨氧化细菌和氨氧化古菌对于土壤水分含量的适应性也不同，从而表现出相异的变化特性。AOA_amoA和AOB_amoA 的基因丰度均在淹水条件下达到最高值，这可能是土壤水分含量改变影响到土壤氧气浓度和底物有效性时[25]，硝化微生物会迅速进行调整以适应新的环境条件。

在反硝化过程中，编码亚硝酸盐还原酶基因(Nir)可作为研究反硝化微生物群落的主要分子标记物[26]。不同土壤水分状况条件下，对于nirS 和nosZ基因丰度的影响趋势相同，低土壤水分含量条件下变化不显著，说明在低土壤含水量条件下，不利于反硝化微生物的生存，氧气含量较高，无法提供反硝化微生物适宜生存的条件。在高土壤水分含量和淹水条件下，nirS 和nosZ 基因丰度显著增长，说明在此条件下形成的微氧环境，有利于反硝化微生物的生存。Uchida 等[27]的研究中，通过对表层土壤淹水处理3 h，nirS 和nosZ 的基因丰度显著增长并达到峰值。反硝化过程是产生N2O 的主要过程[7,28]，氧化亚氮还原酶编码基因(nosZ)可将氧化亚氮还原为氮气，是减少氧化亚氮排放的关键反应。

3.2 土壤水分状况对微生物群落组成的影响

土壤水分含量是影响土壤微生物群落构建的重要因素[29]。目前，土壤水分含量对微生物群落结构影响的研究不断深入，在黑龙江抚远三江湿地保护区，对于黑土开垦影响微生物群落变化规律的研究中，发现土壤含水率差异是影响微生物群落的重要原因[17]。热带高原土壤的研究中，土壤水分含量能够显著影响土壤微生物群落的丰度[30]。有研究表明，土壤水分含量是影响热带森林土壤细菌群落结构和功能的主要因素[5]。

本研究中，4 组水分状况下微生物群落组成组间差异极为显著 (图3)，通过多样性指数分析发现，在高土壤水分处理条件下微生物物种的丰富度和多样性都极显著 (表2)。RB41和硝化螺菌属 (Nitrospira)与土壤水分含量呈负相关，根瘤杆菌属 (Rhizobacter)、黄杆菌属 (Flavobacterium)、假单胞菌属 (Pseudomonas)与土壤水分含量呈正相关(图7)。在Chen 等[31]的研究中发现，在高土壤水分含量条件下变形菌门和拟杆菌门大量繁殖。另外，假单胞菌属(Pseudomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)与节杆菌属(Arthrobacter)、嗜酸杆菌属(Acidibacter)都属于典型反硝化菌属，已有大量报道[10]。相比于低土壤水分含量，根瘤杆菌属在高土壤水分含量条件下显著增长[32]。我们的研究结果表明，部分菌群节杆菌属(Arthrobacter)、嗜酸杆菌属(Acidibacter)适宜在低水分含量条件下生存。以往的研究更多关注的是土壤理化性质的变化对于硝化微生物的影响，而探究关注的水分含量变化对硝化微生物的影响并不清晰[33]。本研究结果表明，硝化菌属中硝化螺菌属(Nitrospira)适合在低土壤水分含量下生长。高土壤水分含量条件下，土壤微生物群落的丰富度高于其他土壤水分条件下，硝化菌群(Nitrosospira)适宜在高土壤水分含量条件下生存，这与荧光定量结果相印证。土壤含水量是影响微生物硝化菌群的重要因素[11]。土壤水分可能影响了土壤养分状况，基于高通量测序对短期3 年连作和长期20 年连作大豆田土壤的微生物群落进行深度解析研究，硝化螺旋菌属将土壤中硝化菌氧化氨生成的亚硝酸盐，继续氧化生成易被作物吸收的氮源形式—硝酸盐，结果表明硝化螺旋菌属能够间接增加土壤的氮肥力[34]。土壤水分状况影响土壤硝化微生物群落结构及丰度，土壤水分状况对其影响可能存在临界值。因而未来的研究需要设定更加精细化的土壤水分和养分梯度试验。

微生物群落是调控土壤养分的重要因素，而土壤的养分循环也反过来塑造着不同的微生物群落[35]。土壤水分含量对微生物群落结构和N2O 排放的延续效应已经被注意到[10,36]。结合实时荧光定量q-PCR 和高通量测序技术及相关分析研究，探究土壤硝化与反硝化微生物数量对土壤水分梯度的响应规律，揭示土壤水分对土壤微生物结构的影响规律，为黑土合理水分管理提供参考，对黑土进行短期水分调节的即时反应提供见解。

4 结论

土壤水分对农田黑土硝化与反硝化微生物群落的影响存在明显差异，在高土壤水分含量和淹水条件下反硝化微生物nirS 和nosZ 丰度显著增长，土壤水分含量的升高通过增加反硝化微生物nosZ 的丰度进一步促进反硝化作用过程，促使N2O 还原成N2。土壤水分含量对农田黑土优势微生物类群产生影响。RB41和硝化螺菌属(Nitrospira)与土壤水分含量呈负相关关系，而根瘤杆菌属(Rhizobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和黄色土源菌属(Flavisolibacter)与土壤水分含量呈现极强的正相关关系，且80% WHC条件下反硝化作用显著增强。