赣南红肉脐橙根际丛枝菌根真菌群落多样性研究

杨梦佳，邹丛荣，王金平，黄荣珍，姬绍晖，谢荣秀，房焕英，黄国敏

（1 南昌工程学院江西省鄱阳湖流域生态水利技术创新中心，江西南昌 330099；；2 宜春市林业局，江西宜春 336099）

丛枝菌根真菌(AM 真菌)是一种内生真菌，能与陆地上80%以上的维管植物形成共生关系[1]。AM真菌通过识别植物根系释放的根系分泌物，如独脚金内酯[2]，利用菌丝侵染植物根系，并在根系细胞内形成丛枝和泡囊，进行营养交换。菌丝可以延伸到根外较远的地方，并且可以深入到根系到达不了的土壤团聚体内，吸收并传递养分和水分给植物[3-5]，而植物则传递给AM 真菌完成生活史所需的碳源物质，如脂肪酸[6-7]。另外，AM 真菌分泌的球囊霉素还能提高土壤团聚结构，改善根系微环境[8]。植物与AM 真菌的这种互利共生关系在低营养条件下更紧密[1]，这对于植物个体的生长，植物群落的构建，以及生态系统的恢复意义重大。AM 真菌种类较多，包含288 种已描述的物种或1700 个假定的物种[9], 不同种类有不同的功能[10-11]。由不同种类的AM 真菌组成的AM 真菌群落对植物生长有不同的影响，其群落结构和多样性决定着生态系统功能和产量[12]。因此，野外AM 真菌群落的调查有利于农业的可持续发展。

柑橘由于具有很高的营养价值，是世界上最受欢迎且广泛种植的水果作物之一。大多数种类的柑橘根系根毛非常少，其营养与水分吸收对AM 真菌的依赖度非常高[13]。相关研究表明AM 真菌能提高柑橘抗性[14-16]，增强柑橘长势[17-18]，改良柑橘果实品质[19]。AM 真菌对柑橘生长的影响与柑橘种类和AM 真菌种类有关[17-18,20]。因此，调控柑橘根系相关的AM 真菌群落被认为是减少化肥使用，促进柑橘产业可持续发展的重要举措[21-22]。脐橙属于柑橘类，营养元素含量高，口味好, 且由于含有丰富的活性物质，如矿物质、类胡萝卜素、精油、维生素和酚类化合物[23-24]。江西省赣州市(赣南地区)以得天独厚的气候条件孕育出的赣南脐橙具有世界一流的果品品质。该地区种植面积世界第一，是全国最大的脐橙主产区，被誉为“中国脐橙之乡”。但目前关于赣南脐橙根际土AM 真菌的调查较为欠缺，且赣南不同栽培地区土壤特点不同，不同栽培区域脐橙根际土AM 真菌群落特征是否有差异值得深入研究。

脐橙各品种中，红肉脐橙风味浓甜芳香[25]，已被列为全国十一大优势农产品之一。本研究以红肉脐橙为研究对象，利用高通量测序技术调查赣南不同区域红肉脐橙根际土的AM 真菌群落组成和多样性，研究其区域差异，并分析土壤因子与AM 真菌群落组成和多样性的关系，以期为赣南红肉脐橙高效促进AM 真菌菌肥的研制，脐橙产业的发展提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 研究区概况和根际土采集

研究区位于赣南章贡区、会昌县和信丰县，属于典型的亚热带季风湿润气候，四季分明，气候温和，热量充沛，雨量充足，无霜期长。年平均气温18.9℃，年平均无霜期287 天，年平均降雨量1605 mm，年日照时数1813 h，昼夜温差较大，非常适合柑橘类植物的生长。该地区多山多丘陵，土壤类型为花岗岩风化作用形成的红壤。土壤具有土层深，黏性大，养分含量低，多种微量元素含量丰富等特点。本研究选择赣南师范大学脐橙种质资源苗圃(章贡区)、会昌县小密乡果农种植的山丘区脐橙果园(会昌县)和信丰县气象局脐橙农业气象实验站(信丰县)，采集红肉脐橙(CitrussinensisOsbeck cv.Cara)根际土壤，3 个采样地土壤基本化学性状见(表1)。红肉脐橙果树树龄为6～10 年，生长阶段施用有机肥。

表1 调查区域红肉脐橙根际土壤化学性状Table 1 Chemical properties of navel orange rhizosphere soil in the survey regions

本研究选择秋季(11 月)进行根际土壤样品的采集(大部分AM 真菌孢子在秋季成熟)。每个地域选择距离50 m 以上的3 个采样点，每个采样点选取3 棵生长条件相似的脐橙果树(树龄7 年生左右)，分别从东、西、南、北4 个方向采样。将3 棵树在不同方向采集的12 个子土样混合作为1 个土样，土壤混合样本共9 个。采样时，选择树下地表杂草较少的果树，除去杂草以及地表约2 cm 的腐殖质层，然后采集土层厚度为2～30 cm 的根系和土壤。脐橙细根较长、较粗，根毛比较少、短，且呈淡黄色，将采集到的根系和土壤混合体，轻轻敲打，筛选出脐橙根系和土壤混合体，轻摇脐橙根系，留在根部的土壤即为脐橙根际土壤。采集的根际土壤分为两部分，一部分低温保存运回实验室，放入-80℃冰箱用于提取AM 真菌DNA，另一部分常温保存运回实验室，风干后用于测定土壤化学性质。

1.2 土壤化学分析

土壤pH 用pH 计(PHS-3D，上海雷磁有限公司，上海，中国)测定，土壤有机质含量采用重铬酸钾比色法测定[26]，土壤碱解氮含量采用碱解扩散法测定[27]，土壤有效磷含量采用钼蓝比色法测定[28]，速效钾含量采用乙酸铵浸提—火焰光度计法(火焰光度计454，狮龙，芝加哥，美国)测定。

1.3 DNA 提取，PCR 扩增和测序

用宏基因组DNA 提取试剂盒(GENErary)根据使用方法参照说明书提取DNA，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量，测定DNA 完整性，用紫外分光光度计测定DNA 纯度和浓度，将提取的DNA于-20℃冰箱冻存。采用实时荧光定量法在PCR 仪(EDC-810 型，北京东胜创新生物科技有限公司)上对AM 真菌rDNA 基因进行PCR 扩增，第一轮扩增引物为AML1F (正向引物，5′-ATCAACTTTCGAT GGTAGGATAGA-3′) 和AML2R (反向引物，5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCCTTGGTTTCC-3′)，第二轮扩增的引物为AMV4.5NF (正向引物，5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′)和AMDGR(反向引物，5' -CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′)[29-30]。第一次PCR 反应体系为20 μL，其中，5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mg/mol dNTPs 2 μL，引物(5 μg/mol)各0.8 μL，FastPfu 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng。反应条件为：预变性，95℃，3 min；95℃，30 s，55℃ 30 s；72℃ 45 s，32 次循环；将第一轮PCR 产物稀释10 倍，作为第二轮PCR 扩增的模板。第二轮PCR 反应体系与第一轮PCR 反应相同，反应条件为：95℃预变性3 min；95℃30 s；55℃ 30 s；72℃45 s，30 个循环。最终扩增产物用2%的琼脂糖凝胶提取，按照说明书用凝胶回收试剂盒纯化。由北京百迈客生物技术有限公司的Illumina MiSeq 平台对PCR 扩增产物进行高通量测序，用QIIME2 中classify-consensus-blast 将特性序列与GreenGene 数据库(http://greengenes.secondgenome.com/) 比对，不能精确比对上参考数据库的使用classfy-sklearn 分类器分类，使用DADA2 算法通过序列校正获得单碱基精度的操作单元，即扩增子序列变异(ASVs)，进行物种注释。根据ASVs，用软件QIIME2 计算物种多样性指数。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 20.0 软件对不同地域红肉脐橙根际土壤理化性质、AM 真菌多样性指标等进行Duncan 法多重比较(multiple comparisons)，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05 为差异显著。采用R 4.0 软件绘制土壤AM 真菌ASVs 韦恩图和属水平优势物种相对丰度图，以及AM 真菌物种与土壤化学性质的相关性图。采用Canoco 5.0 绘制AM 真菌群落多样性与土壤理化性质的冗余分析(RDA)图。

2 结果与分析

2.1 不同地域红肉脐橙根际土化学性质概况

赣南3 个地域的红肉脐橙根际土壤化学性质差异大，土壤pH 范围为3.70～7.30，土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量范围分别为15.75～76.60 g/kg、21.00～154.00 mg/kg、77.52～192.80 mg/kg 和143.60～327.80 mg/kg (表1)。多重比较结果表明，会昌县红肉脐橙根际土碱解氮含量显著高于章贡区和信丰县(P＜0.05)，而其他土壤化学性质则在不同地域间差异不显著。

2.2 不同地域红肉脐橙根际AM 真菌群落ASV组成及结构

所有样本AM 真菌ASV 数量随基因序列数的变化曲线最终均趋于平缓(图1A)，且文库覆盖度达到99%以上，因此测序结果可靠。3 个区域红肉脐橙根际土壤中总共检测出90437 条AM 真菌基因序列，共得到186 种AM 真菌ASV，章贡区、会昌县和信丰县红肉脐橙根际土中ASV 总类数分为67、63 和102。将获得的ASVs 进行分类，发现本次土壤样品中的AM 真菌隶属于1 门、3 纲、3 目、4 科、4 属、16 种。维恩(Venn)图可以直观地体现不同地域红肉脐橙根际土中AM 真菌 ASV 组成的差异及共有物种的情况(图1B)。在ASV 水平上，章贡区、会昌县和信丰县独有AM 真菌ASV 分别为27、26 和68 个，章贡区与会昌县共同ASV 为26 个，章贡区与信丰县共同 ASV 为23 个，会昌县与信丰县共同ASV 为20 个，3 个区域共同ASV 为9 个。

图1 红肉脐橙根际土AM 真菌群落的稀释曲线(A)和ASV 韦恩图(B)Fig.1 Dilution curve (A) and ASV Venn diagram (B) of AM fungal community in rhizosphere soil of Citrus sinensis Osbeck cv.Cara

2.3 不同地域AM 真菌群落α 多样性分析

在97% 序列相似水平上计算的ASV 数量、Shannon 指数和Pielous 指数表征红肉脐橙根际土中AM 真菌的α 多样性。ASV 数量代表AM 真菌群落的丰富度，ASV 数量越高，这表明AM 真菌群落的丰富度越高，红肉脐橙根际土中AM 真菌的丰富度越大；Shannon 指数代表AM 真菌群落的多样性，Shannon 指数越高表明AM 真菌群落多样性越高；Pielous 指数代表AM 真菌群落的均匀度，Pielous 指数越高，说明AM 真菌各物种个体数目越均匀，不同物种间在数量上越接近。

本研究中，不同地域间红肉脐橙根际土中AM真菌的α 多样性(ASV 数量、Shannon 指数和Pielous指数) 差异显著。信丰县红肉脐橙根际土AM 真菌Shannon 指数均显著高于章贡区和会昌县，ASV 数量显著高于会昌县(P＜0.05，图2A 和B)，同时，信丰县红肉脐橙根际土AM 真菌Pielous 指数也显著高于章贡区(P＜0.05，图2C)，而章贡区和会昌县AM真菌的α 多样性指数均无显著差异。

图2 采样区域红肉脐橙根际土AM 真菌群落α 多样性Fig.2 α-Diversities of AM fungal community in rhizosphere soil of navel orange in the sampled regions

2.4 赣南不同地域AM 真菌群落分类学组成及丰度

在3 个地域红肉脐橙根际土中共检测出AM真菌4 个属，分别是球囊霉属Glomus、原囊霉属Archaeospora、近明球囊霉属Claroideoglomus、类球囊霉属Paraglomus(图3A)。其中，球囊霉属Glomus为AM 真菌群落的绝对优势属，平均相对丰度达97.70%，其相对丰度在3 个地域红肉脐橙根际土中排序为章贡区(99.86%)＞会昌县＞(97.88%)＞信丰县（95.36%）。球囊霉属Glomus的相对丰度在不同地域红肉脐橙根际土中并无显著差异(表2)。

图3 采样地区红肉脐橙根际土AM 真菌在属和种水平上物种相对丰度Fig.3 AM fungal community composition in rhizosphere soil of navel orange at genus and species levels in the sampled regions

表2 红肉脐橙根际土 AM 真菌相对丰度差异性检验Table 2 Difference test of the relative abundance of AM fungi in the rhizosphere soil of navel orange among the sampled regions

3 个地域共检测出AM 真菌16 个种，相对丰度前6 的AM 真菌均属于Glomus属，分别为Glomus_sp(18.52%)、Glomus_Toljander08-Glo2_VTX00219(8.77%)、Glomus_Toljander08-Glo8_VTX00113(6.77%)、Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222(4.76%)、Glomus_LES06_VTX00310(2.56%)、Glomus_LH-Gl05(1.16%) (图3B)。其中，Glomus_sp为优势种，其相对丰度在3 个地域排序为会昌县＞章贡区＞信丰县，但其相对丰度在3 个地域红肉脐橙根际土中无显著差异。相对丰度差异性分析结果表明相对丰度前6 的AM 真菌菌种中，Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222在信丰县红肉脐橙根际土的相对丰度显著高于其他两个地域(P＜0.05)，而其他5 个菌种在不同地域红肉脐橙根际土中无显著差异(表2)。

2.5 AM 真菌群落和土壤因子的关系

AM 真菌群落多样性因子与土壤环境因子相关性的冗余分析(RDA) 结果表明，RDA 两轴共解释了AM 真菌群落α 多样性39.77%的变异，第一轴和第二轴的解释度分别为36.38%和3.39% (图4A)。土壤因子中，对AM 真菌群落α 多样性影响最大的是土壤有机质，贡献率达66%以上(图4B)。从RDA 结果图可知，土壤有机质与AM 真菌群落α 多样性(ASV 数量、Shannon 指数和Pielous 指数)呈较强的负相关关系，土壤pH 则与AM 真菌群落α 多样性指数呈较强的正相关关系。另外，土壤有效磷也与ASV 数量、Shannon 指数呈较强的负相关关系。

图4 AM 真菌群落多样性与土壤因子的RDA 分析Fig.4 Canonical correspondence analysis (RDA) between AM fungal community diversities and soil factors

RDA 结果表明，RDA 两轴共解释了AM 真菌种群群落结构分布的64.85% (图5A)，第一轴和第二轴解释度分别为54.08%和10.77%，土壤有效磷、碱解氮和有机质含量均对AM 真菌群落结构有较大影响(图5B)。AM 真菌群落结构在3 个地域间差异不显著。相关性分析结果表明，土壤因子对红肉脐橙根际土中相对丰度较高的AM 真菌具有消极影响。在属水平上，Archaeospora的丰度与土壤速效钾呈显著负相关(r=-0.794，P＜0.05，图6A)；在种水平上，Glomus_Toljander08-Glo8_VTX00113的丰度与土壤有效磷呈显著负相关(r=-0.687，P＜0.05)，Glomus_LES06_VTX00310 的丰度与土壤速效钾呈显著负相关(r=-0.692，P＜0.05)，而Glomus_Toljander08-Glo2_VTX00219则与土壤速效钾和碱解氮均呈显著负相关(r=-0.739，P＜0.05；r=-0.692，P＜0.05)，而与土壤pH 呈显著正相关(r=0.667，P＜0.05，图6B)。在AM 真菌物种中，Glomus与Claroideoglomus呈极显著负相关(P＜0.001)，Glomus_Toljander08-Glo8_VTX00113与Glomus_LES06_VTX00310、Glomus_LH-Gl05呈显著正相关(P＜0.05)，Glomus_LH-Gl05还与Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222呈显著正相关(P＜0.05)。

图5 AM 真菌群落结构与土壤因子的RDA 分析Fig.5 Canonical correspondence analysis (RDA) between AM fungal community structures and soil factors

图6 AM 真菌物种与土壤因子的相关性分析Fig.6 Correlation analysis of AM fungal species and soil factors

3 讨论

新一代高通量测序技术—基于Illumina MiSeq 的高通量测序技术具有灵活性高、高通量、读长更长、深度更深和错误率更低等特点，被认为是研究AM 真菌群落结构和鉴定AM 菌种最有效的分子技术之一[31]。在应用高通量测序技术中，大多数研究采用的是基于UPARSE 算法通过97%相似度聚类获得的OTU，再进行物种注释。本研究采用的则是基于DADA2 算法通过序列校正获得单碱基精度的操作单元，及扩增子序列变异(ASVs)。相比UPARSE 算法，DADA2 算法可以识别更多的真实序列，输出更少的伪序列，提高了精确度[32]。基于该算法，本研究共检测出了90437 条AM 真菌基因序列，186 种ASVs，表明红肉脐橙根际土壤中蕴含着丰富的AM真菌资源。红肉脐橙根际土共有AM 真菌4 个属，其中球囊霉属Glomus为绝对优势属(95%以上)，这与前人[33-35]的研究结果一致。这是因为球囊霉属对环境有更强的适应性[36-37]，不仅可以通过孢子繁殖，还可以通过残留的菌丝片段进行繁殖[38]，因此相对其他种类的AM 真菌具有更高的繁殖速率和强度。同时这也说明球囊霉属Glomus对红肉脐橙的选择偏好性更强。红肉脐橙根际AM 真菌物种之间也存在竞争和合作关系，如Glomus与Claroideoglomus存在竞争关系，Glomus_Toljander08-Glo8_VTX00113与Glomus_LH-Gl05和Glomus_LES06_VTX00310、Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222与Glomus_LHGl05存在合作关系。

赣南地区红壤养分含量低，而脐橙生长对土壤养分要求较高，果实品质也与土壤养分有关，因此赣南地区脐橙的种植施有机肥比较普遍，脐橙根际土壤有机质、有效磷和速效钾的含量均较高。本研究选取土壤养分特征不同的3 个县域进行红肉脐橙根际土壤AM 真菌群落的研究，发现信丰县红肉脐橙根际AM 真菌群落多样性(ASV 数量、Shannon 指数和Pielous 指数)高于章贡区和会昌县，其中，其Shannon 指数显著高于章贡区和会昌县，ASV 数量显著高于会昌县，Pielous 指数显著高于章贡区，说明信丰县红肉脐橙根际土壤AM 真菌种类更丰富，这再一次验证了生境是影响AM 真菌群落多样性的一个重要因素[39]。信丰县红肉脐橙根际AM 真菌群落多样性更高说明该区域红肉脐橙与AM 真菌建立了更加紧密的互利共生关系。通过冗余分析发现，土壤有机质是影响红肉脐橙根际AM 真菌群落多样性最主要的土壤因素，其对AM 群落多样性具有消极影响，这与Jiang 等[40]的meta 分析结果相一致。当肥力提高时，植物可以减少从AM 真菌获取营养元素，同时减少向AM 真菌提供其所需的碳类化合物，因此加剧了竞争关系，减少了AM 真菌多样性，改变了AM 真菌物种组成[41-44]。另一种解释是有机质增加有利于细菌或某些真菌的繁殖，从而加剧了AM 真菌与其它微生物的竞争，使得竞争失败的某些AM 真菌种类消失[45]。因此，本研究中章贡区和会昌县红肉脐橙根际土壤有机质含量明显高于信丰县，但AM 真菌群落多样性却低于信丰县。另外，AM 真菌群落多样性与土壤pH 有关，过酸过碱的土壤环境均不利于AM 真菌生长繁殖[46-47]。本研究区位于南方红壤区，土壤pH 较低，因此土壤pH 与AM 真菌群落多样性呈正相关关系。信丰县红肉脐橙根际更高的AM 真菌群落多样性也与其根际土壤更高的pH 有关。

生境对AM 真菌群落结构也有重要影响[48]。本研究中，不同地域红肉脐橙根际各AM 真菌菌种在属水平上和种水平上相对丰度的平均值虽然差异较大，但差异并未达显著水平，这说明地域并未显著影响红肉脐橙根际AM 真菌群落结构。值得注意的是AM 真菌中，Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222在信丰县红肉脐橙根际土壤中的相对丰度显著高于其它两个区，是信丰县红肉脐橙根际土壤标志菌种。生态系统中AM 真菌群落不仅与各菌种对宿主植物的选择偏好性有关[49]，还与当地土壤特性有关[50]。本研究中，相比章贡区和信丰县，会昌县红肉脐橙根际土中Glomus_sp相对丰度更高，而Glomus_Toljander08-Glo2_VTX00219、Glomus_Toljander08-Glo8_VTX00113、Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222等的相对丰度更低，主要是因为会昌县红肉脐橙根际土壤碱解氮含量显著高于章贡区和信丰县。本研究关于 AM 真菌菌种与土壤因子的相关性分析还发现，赣南红肉脐橙根际土壤肥力(速效钾、有效磷、碱解氮和有机质) 会提高优势菌种Glomus_sp的相对丰度，却会降低其它主要AM 真菌菌种(如Glomus_Toljander08-Glo2_VTX00219、Glomus_Toljander08-Glo8_VTX00113、Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222等)的相对丰度，这可能与红肉脐橙在人工种植过程中过量施入有机肥有关。AM 真菌-植物-土壤肥力存在一个平衡，当土壤肥力过低时，植物获得的能量少，提供给AM 真菌的碳源少，因此AM 真菌生长繁殖受到限制；而当土壤肥力过高时，植物与AM 真菌的互利共生关系较低，也会更少地提供AM 真菌碳源，因此也会抑制AM 真菌群落的发展[43,51]。本研究中土壤高肥力抑制了大多数菌种的发展，从而间接提高了最优势菌种Glomus_sp的相对丰度。

4 结论

柑橘类植物的生长对AM 真菌的依赖度高，本研究利用高通量测序技术研究地域对柑橘类植物之一—红肉脐橙根际AM 真菌群落的影响，发现赣南红肉脐橙根际AM 真菌资源较为丰富，但主要以球囊霉属(Glomus) 为主，地域主要影响AM 真菌群落的α 多样性，而非群落结构。各AM 真菌菌种中，Glomus_Toljander08-Unk1_VTX00222在各栽培区红肉脐橙根际土壤中差异显著。另外，土壤有机质是影响红肉脐橙根际AM 真菌群落α 多样性的主要因素，其对AM 真菌群落α 多样性具有消极影响，因此，在红肉脐橙栽培过程中，过量施用有机肥会降低AM 真菌群落多样性。