基于TXNIP/NLRP3炎性小体通路研究清热凉血方对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障的保护作用

范咸玉 邹建文 陈旭 吴刚

(都江堰市医疗中心消化内科,四川 成都 611830)

溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠疾病,在结肠中发生,伴有腹痛、直肠出血和腹泻,具有发展为结直肠癌的风险〔1〕。UC的发生和发展涉及的确切机制尚未完全阐明。许多研究发现,肠道免疫系统受损失衡和肠黏膜屏障损伤可能有助于UC的发生、发展〔2〕。不平衡的黏膜免疫系统导致促炎细胞因子的产生,这又反过来导致慢性炎症、溃疡及结肠黏膜病变,诱发肠屏障损伤,引起肠道菌群移位和内毒素血症〔3〕。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3炎性小体已经被证实在UC中具有致病作用,这使得NLRP3炎性小体成为UC治疗的潜在靶标〔4〕。清热凉血方(QRLX)是在中医理论指导下结合多年临床经验及现代药理学研究而形成的自拟方药,由白头翁、紫草、生地榆、黄连、黄柏、槐角、白芍、甘草组成,具有清热解毒,凉血活血的功效。现代研究发现QRLX具有增强免疫、抗炎、抗氧化等多种药理作用〔5〕,吴超等〔6〕发现QRLX可清除氧自由基,抑制脂质过氧化,减少急性放射性肠炎大鼠结肠黏膜损伤。而QRLX是否对UC有保护作用尚不明确,本研究旨在探究QRLX对UC大鼠肠黏膜损伤的影响与机制。

1 材料和方法

1.1动物 从北京维通利华实验动物技术有限公司〔许可证号为SCXK(京)2019-0009〕购入78只雄性SD大鼠,8周龄,体质量(190±10)g。所有大鼠在温度(24±2)℃,湿度(55±5)%的环境下饲养,并保持12 h光/暗循环。

1.2试剂 QRLX:白头翁、紫草、生地榆各30 g、黄连、黄柏、槐角、白芍、甘草各15 g。以上药材均为中药配方颗粒,购自华润三九医药股份有限公司;使用时将所有配方颗粒混匀后加入蒸馏水配制成混悬液。柳氮磺吡啶(SASP)肠溶片(上海信谊天平药业有限公司);葡聚糖硫酸钠(DSS,分子量:36 000～50 000 Da,货号:9011-18-1,美国MP Biomedicals);异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-dextran,美国Sigma-Aldrich公司,货号:53471-1G);大鼠内毒素(ET,RA20354)、D乳酸(LA,RA20770)及二胺氧化酶(DAO,RA20028)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(上海碧云天生物科技公司,C0105S);兔抗紧密连接蛋白(ZO)-1(ab96587)和occludin(ab216327)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP,ab188865)、NLRP3(ab263899,英国Abcam公司);小鼠抗切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cl-caspase)-1 p10(sc-56036)、cl-caspase-1 p20(sc-398715)抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.3造模与分组 采用DSS诱导UC大鼠模型〔7,8〕。具体操作为在造模大鼠饮用水中加入5%(W/V)的DSS,连续7 d,随后提供常规饮用水3 d,对照组接受常规饮用水。模型建立后,观察大鼠一般状态,并随机选取6只大鼠取结肠组织进行HE染色,观察模型是否成功。结果显示造模大鼠精神萎靡、倦怠少动、食欲减退同时出现便血、腹泻现象,肠黏膜上皮细胞水肿,绒毛两边上皮成块脱落,有明显溃疡,且大量炎性细胞浸润,说明模型制备成功。将造模大鼠分为UC组、SASP组(270 mg/kg)、清热凉血方低(QRLX-L,14.8 g/kg)、中(QRLX-M,29.6 g/kg)、高剂量组(QRLX-H,59.2 g/kg),每组12只;另取12只大鼠为对照(Control)组。分组完成后,Control组和UC组不进行药物干预,仅灌胃蒸馏水;SASP组和QRLX各剂量组灌胃相应剂量的药物,每天分早晚2次给药,共给药2 w。

1.4取材及指标检测

1.4.1肠道渗透性检测 在末次给药20 h时,在每组中选取6只大鼠,灌胃FITC-dextran(PBS溶解,灌胃剂量440 mg/kg),4 h后,经眼眶静脉取血并离心取血清,用荧光分光光度计(激发波长485 nm,发射波长528 nm)测量血清吸光度值。

1.4.2血浆肠屏障功能受损标志物DAO活性、D-LA、ET含量测定 给药结束24 h后,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉剩余6只大鼠,取血2 ml放入普通肝素抗凝管中,另取1 ml放入无热原的ET测定专用管中,于4 ℃冰箱中放置2 h。离心(3 000 r/min,5 min)取血浆,检测血浆DAO活性、D-LA、ET水平。

1.4.3HE染色观察结肠组织病理学变化 取血完成后,取部分结肠组织固定在4%多聚甲醛中,石蜡包埋、切片,进行苏木素和伊红染色,光学显微镜下观察结肠组织形态学变化。

1.4.4ELISA检测结肠组织中白细胞介素(IL)-1β、IL-18含量 另取部分结肠组织,加生理盐水研磨制备10%组织匀浆液,ELISA检测结肠组织匀浆中IL-1β、IL-18含量。

1.4.5免疫组化法观察肠屏障功能相关蛋白occludin、ZO-1的表达 取1.4.3石蜡包埋的结肠组织切片,抗原修复后,4 ℃下与occludin、ZO-1一抗(1∶100)孵育过夜,二抗显色后于光学显微镜下观察occludin、ZO-1阳性表达情况,用Image pro-Plus(IPP)6.0计算平均光密度(AOD)。

1.4.6Western印迹检测TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达 RIPA裂解液提取结肠组织总蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量(30 μg)蛋白样品,经转膜、封闭后,将膜在4 ℃下与一抗(TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1 p10、cl-caspase-1 p20、β-actin,1∶1 000稀释)孵育过夜,隔日,洗去一抗,将膜在室温下与二抗(1∶5 000)孵育2 h,显影,ImageJ软件对蛋白条带灰度值进行分析。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析和Tukey检验。

2 结 果

2.1各组肠道渗透性比较 与Control组〔(224.16±28.51)ng/ml〕相比,UC组血清FITC-dextran浓度〔(579.25±34.82)ng/ml,P<0.05〕显著升高;与UC组相比,SASP组、QRLX-H组、QRLX-M组、QRLX-L组血清FITC-dextran浓度明显降低〔(386.37±32.35)、(391.62±36.80)、(484.30±41.56)、(521.24±50.13)ng/ml,均P<0.05〕,且QRLX各剂量组呈一定的剂量依赖性;与SASP组相比,QRLX-H组血清FITC-dextran浓度差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组血浆DAO、D-LA、ET水平 与Control组相比,UC组DAO活性、D-LA、ET水平明显升高(P<0.05);与UC组相比,SASP组、QRLX-H组、QRLX-M组上述指标明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组血浆DAO、D-LA、ET水平比较

2.3各组结肠组织病理学变化 Control组结肠未见明显病理损伤;UC组肠黏膜水肿变薄,绒毛两边上皮成块脱落,大量炎性细胞浸润,肠黏膜固有层内腺体有灶性坏死,形成糜烂点;SASP组、QRLX-H组、QRLX-M组病理损伤明显改善,可见部分肠黏膜上的绒毛轻度肿胀,肠黏膜轻微脱落,少量炎性细胞浸润,溃疡灶数量及溃疡面积减少;其中以SASP组、QRLX-H组改善效果更为明显。见图1。

图1 各组结肠组织形态学(HE染色,×100)

2.4各组结肠组织中IL-1β、IL-18水平 与Control组相比,UC组IL-1β、IL-18水平明显升高(P<0.05);与UC组相比,SASP组、QRLX-H组、QRLX-M组IL-1β、IL-18水平明显降低(P<0.05),且QRLX各组存在一定剂量依赖性;与SASP组相比,QRLX-M组、QRLX-L组结肠匀浆中IL-1β、IL-18水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组结肠组织中IL-1β、IL-18水平、occludin、ZO-1及TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达比较

2.5各组肠屏障功能相关蛋白occludin、ZO-1表达 与Control组相比,UC组结肠occludin、ZO-1蛋白分布不均且染色变淡,表达显著减少(P<0.05);与UC组相比,SASP组、QRLX-H组、QRLX-M组结肠occludin、ZO-1蛋白分布较为均匀,表达明显升高(P<0.05),且QRLX各组存在一定剂量依赖性;与SASP组相比,QRLX-M组、QRLX-L组occludin、ZO-1蛋白表达明显降低(P>0.05)。见表2、图2。

图2 各组结肠组织occludin、ZO-1蛋白(免疫组织染色,×200)

2.6各组结肠组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白的表达 与Control组相比,UC组TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1 p10、cl-caspase-1 p20表达明显升高(P<0.05);与UC组相比,SASP组、QRLX-H组、QRLX-M组上述蛋白表达明显降低(P<0.05);与SASP组比较,QRLX-L组上述蛋白表达明显升高(P<0.05)。见表2、图3。

3 讨 论

UC的治疗包括外科治疗和药物治疗,除了常规使用抗炎药美沙拉嗪和SASP、糖皮质激素及氨基水杨酸外,许多新药如抗肿瘤坏死因子抗体也被广泛应用于临床实践〔9,10〕。然而,UC在治疗后的一定时间内常出现复发。

中医学将UC中归属于“痢疾”“泄泻”“肠癖”等范畴,其发病与“湿热”“热毒”密切相关,病机主要为湿热蕴结于肠道,在肠道相互裹挟,导致肠道传导失司、气血壅滞、肠络受损而致下痢脓血〔4,6〕。QRLX由白头翁、紫草、生地榆、黄连、黄柏、槐角、白芍、甘草组成。其中白头翁归大肠经,善清胃肠湿热;紫草甘寒,凉血活血清热解毒,4者共为君药,可清热凉血解毒。生地榆治疗便血效果显著,可清热、凉血、生肌;黄连可除脾胃肠道湿热,黄柏主入下焦,槐角清热泻火,四者共为臣药引药直达肠道。甘草、白芍可缓热毒所致阴津亏损,甘草还可调和药性,以上诸药合用共奏清热凉血解毒的功效。现代药理研究发现白头翁可抑制炎症反应,改善UC患者结肠黏膜溃疡程度〔11〕;且其主要成分白头翁皂苷B4能抑制炎症因子IL-6、TNF-α的释放,有显著地保护及修复实验性UC大鼠溃疡的作用〔12〕。紫草中的紫草素具有显著的抗炎、调节免疫作用〔13,14〕;且地榆、黄柏、黄连及其主要成分小檗碱均可降低炎症反应,促进肠道黏膜屏障功能改善,是治疗UC方药中常用的中药〔15,16〕。以上研究提示QRLX具有治疗UC的潜力。

本研究说明,UC大鼠肠黏膜出现明显损伤;血浆ET、D-LA和DAO水平是肠屏障功能受损的标志物,正常情况下在血浆中含量很少,当肠道屏障功能损害时,肠道内ET、DAO、D-LA大量释放入血〔17〕;肠occludin和ZO-1是肠上皮细胞的骨架结构,构成肠黏膜的第一道防线,维持肠屏障功能的完整性〔18〕。本研究结果说明,UC大鼠出现明显的肠屏障功能障碍,提示QRLX可显著减轻UC大鼠的肠黏膜损伤,改善大鼠肠屏障功能障碍。

IL-1β和IL-18是UC的重要致病因素,其分泌受激活的caspase-1的调节,而caspase-1的成熟及释放受NLRP3炎症小体的严格调控〔19〕。NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合物,由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)与前半胱天冬酶(pro-caspase)-1组成。NLRP3蛋白是NLRP3炎性小体的活性核心;研究已经证实,NLRP3炎性小体在UC中被激活〔4〕。TXNIP在细胞质和线粒体中表达,正常情况下,TXNIP以与TRX结合的形式存在,当机体受到内源或外源性刺激时,TRX与TXNIP分离,促使TXNIP与NLRP3结合,导致NLRP3炎症小体激活〔20〕;随后,pro-caspase-1会裂解产生活性cleaved-caspase-1(p10、p20),并将pro-IL-1β和pro-IL-18裂解为成熟的IL-1β和IL-18,调控慢性炎症〔21〕。近年研究发现TXNIP可能是治疗炎症性肠病的潜在治疗靶标〔7〕。Jia等〔22〕发现二甲双胍可抑制TXNIP表达,阻止了TXNIP与NLRP3的结合,抑制NLRP3炎性小体的激活,可保护肠屏障功能免受肠道缺血再灌注损伤并降低氧化应激和炎症反应。本研究结果提示,QRLX降低IL-1β和IL-18水平,抑制炎症反应的作用可能是通过抑制TXNIP/NLRP3炎性小体通路实现的。