上调miR-145-5p对急性脑梗死模型大鼠干预作用及机制

彭旭 姜波涛 张丹 刘杰 李双

(长沙市第一医院神经内科,湖南 长沙 410000)

临床医学将因突发性的脑组织供血中止导致脑组织坏死的症状定义为急性脑梗死,在脑卒中患者中占比接近90%,是最常见的脑血管疾病〔1,2〕。急性脑梗死多发于中老年人群,患者主要临床表现为半身不遂、突发性眩晕、头痛等,具有病起突然、严重程度高、治疗难度大、预后差等特征〔3,4〕。目前临床尚无特效的治疗急性脑梗死的药物,因此研究其发病分子机制,探寻新的治疗靶点成为重点研究方向〔5〕。有研究表示,miR-145-5p在急性脑梗死中呈异常表达,其表达变化与急性脑梗死患者病情密切相关,但是关于调控miR-145-5p对急性脑梗死干预效果的研究鲜有报道〔6〕。本研究建立急性脑梗死大鼠模型,调控大鼠miR-145-5p表达,旨在探究调控miR-145-5p表达对急性脑梗死模型大鼠的干预效果及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 选取40只SD健康雄性大鼠〔北京科兴中维生物技术有限公司,使用许可证号:SYXK(京)2020-0054〕,鼠龄10～12 w,平均(10.9±0.7)w;体质量221～252 g,平均(236.5±12.4)g。所有大鼠于(23.2±1.9)℃环境中喂养。本研究获长沙市第一医院伦理委员会批准。主要试剂:antago miR-145-5p、ago miR-145-5p(北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗大鼠Toll样受体(TLR)4抗体(Gibco公司);大鼠抗小鼠核因子(NF)-κB p65抗体(Dako公司);大鼠抗小鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(Invitrogen公司);小鼠抗兔白细胞介素(IL)-1β抗体(Sigma公司);小鼠抗大鼠B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(Selleck公司);兔抗大鼠微管相关蛋白(LC3)-Ⅱ抗体(Hyclone公司);小鼠抗兔自噬效应蛋白(Beclin)-1抗体(BD公司)。

1.2建模及分组干预 随机挑选10只为正常组,其余30只建立急性脑梗死模型:固定后进行麻醉处理,大鼠失去意识后颈部消毒,将中央部位皮肤切开,显微镜下分离颈外动脉(ECA)、颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA),近心端结扎近端ECA,应用微动脉夹夹住ICA,CCA进行结扎固定,阻断脑组织中动脉后将微动脉夹取下,并对ICA进行固定,缝合创口并消毒。大鼠建模后出现病灶对侧前肢无法伸直、行走时向病灶对侧旋转、按住尾巴向病灶对侧旋转等状况视为建模成功,将实验过程中死亡大鼠剔除,建模成功25只,随机分为上调组9只,脑梗死组、下调组各8只。下调组腹腔注射antago miR-145-5p 30 mg/kg,上调组腹腔注射ago miR-145-5p 30 mg/kg,正常组、脑梗死组腹腔注射等量生理盐水。4组均连续干预7 d。

1.3学习、记忆能力检测 设计Y型迷宫,并将大鼠置于其中自由活动10 min,60 V电压对大鼠电刺激6 s,电刺激开始后大鼠直接逃至安全区为正确反应,大鼠逃至安全区后停留0.5 min后再次置入电刺激区域反复训练。连续训练10次中9次符合正确反应标准为训练合格,记录各组学习合格所用训练次数。Y型迷宫训练次日再次训练,记录各组10次训练正确反应次数。

1.4脑梗死面积、含水量检测 取各组腹部静脉血3 ml,离心半径10 cm,转速2 500 r/min离心处理15 min,-30 ℃保存。分别于干预3、5、7 d时间点对脑梗死面积、含水量进行检测:在各时间点,各组麻醉后颈椎脱臼法处死2只,取脑组织冷藏0.5 h,2 mm厚度切片,使用2%红四氮唑(TTC)溶液染色,0.5 h后4%甲醛固定,拍照后对梗死面积进行计算。含水量检测:将脑组织表面水分吸除后称重,置于烤箱中烤至恒重,称取干质量,脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量。

1.5HE染色 大鼠脑组织固定后使用4%甲醛浸泡1 d,石蜡包埋、切片,烤干后进行脱蜡处理,不同浓度酒精复水、苏木素染色,分化、冲洗后进行乙醇梯度脱水,伊红染色、乙醇梯度脱水、脱蜡后封片,显微镜观察。

1.6Western印迹法检测TLR4/NF-κB通路、凋亡、自噬相关蛋白表达 使用裂解液对大鼠脑组织切片进行干预后提取50 μg蛋白,煮沸、蛋白定量后十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、转膜后室内封闭2.5 h,之后1∶2 000添加一抗进行孵育,4 ℃孵育,1 d后取出TBST清洗3次,1∶5 000添加二抗,孵育1 h,再次TBST清洗3次,显色、曝光、成像,检测条带灰度值,检测TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、Beclin-1相对表达量。

1.7酶联免疫吸附试验检测炎症因子水平 标记酶标板,稀释标准品,设置空白孔、对照孔、观察孔,空白孔添加终止液、显色剂,对照孔添加稀释后标准品,观察孔添加血清标本、抗体,封膜、充分摇晃后置于37 ℃保温箱中培养,2 h后取出去膜清洗,吸干水分,添加显色剂后震荡,显色后添加终止液,450 nm处测吸光值,计算TNF-α、IL-1β水平。

1.8统计学处理 采用SPSS26.0软件,多组对比行F检验,组间对比行独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组脑组织病理学观察 正常组脑组织细胞排列紧密、规则,结构、形态均正常,无病理变化。脑梗死组、下调组脑组织细胞排列较为杂乱无序,且结构、形态异常,出现细胞核破裂现象,炎性细胞浸润明显。上调组脑组织细胞排列较为规则,细胞结构、形态改善,炎性细胞浸润情况明显减轻。见图1。

2.2各组学习、记忆能力比较 脑梗死组、下调组、上调组达标所需训练次数高于正常组、记忆能力低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);上调组达标所需训练次数低于脑梗死组、下调组,记忆能力高于脑梗死组、下调组,差异有统计学意义(P<0.05);下调组达标所需训练次数高于脑梗死组,记忆能力低于脑梗死组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组学习、记忆能力比较

2.3各组脑组织梗死面积、含水量情况 与脑梗死组比较,干预3、5、7 d后下调组梗死面积、脑组织含水量升高,上调组梗死面积、脑组织含水量降低,差异有统计学意义(P<0.05);与下调组比较,干预3、5、7 d后上调组梗死面积、脑组织含水量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组脑组织梗死面积、含水量比较

2.4各组TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎症因子水平比较 脑梗死组、下调组、上调组TLR4、NF-κB p65表达及TNF-α、IL-1β水平均显著高于正常组;下调组上述指标均显著高于脑梗死组;上调组上述指标均显著低于脑梗死组、下调组(P<0.05)。见表3,图2。

表3 各组TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎症因子水平及凋亡、自噬相关蛋白表达比较

图2 各组TLR4/NF-κB通路蛋白表达

2.5各组凋亡、自噬相关蛋白表达对比 脑梗死组、下调组、上调组Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著高于正常组,Bax表达显著低于正常组(P<0.05);下调组Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著高于脑梗死组,Bax表达显著低于脑梗死组(P<0.05);上调组Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著低于脑梗死组、下调组,Bax表达显著高于脑梗死组、下调组(P<0.05)。见表3,图3。

图3 各组凋亡、自噬相关蛋白表达

3 讨 论

急性脑梗死患者病死率较高,且其发病机制尚未研究透彻,因此许多学者尝试通过基础医学等途径对急性脑梗死发病机制、干预方法进行研究〔7,8〕。miRNA在生物体中大量存在,在机体免疫系统、神经系统、组织细胞增殖、凋亡等过程中具有重要作用〔9〕。miR-145-5p为miRNA家族的重要组成成员,miR-145-5p表达变化与癌细胞生物学活性密切相关〔10,11〕。调控miR-145-5p表达能够促进小胶质细胞活化,从而起到脑保护作用。

大量临床研究表明,急性脑梗死患者神经功能、认知功能会受到严重损伤〔12,13〕。有研究通过动物实验研究表明,对脑梗死大鼠进行干预,能够改善其神经功能及学习记忆能力〔14〕。本研究说明急性脑梗死大鼠神经功能出现一定程度的损伤,导致学习记忆能力明显下降,上调miR-145-5p表达能够改善大鼠学习记忆能力,改善大鼠神经功能,可能是由于上调miR-145-5p表达促进大鼠小胶质细胞活化,从而减轻大鼠神经功能损伤严重程度。本研究结果体现上调miR-145-5p表达能够发挥一定的脑保护作用。本研究说明上调miR-145-5p表达能够抑制急性脑梗死大鼠脑组织炎症反应。大量研究表示,随着急性脑梗死的发生发展,机体脑组织出现一定程度的炎症反应,脑组织炎症反应是导致机体神经功能损伤的主要因素〔15,16〕。TLR4/NF-κB通路蛋白表达变化与机体炎症反应具有密切联系,TNF-α、IL-1β均为TLR4/NF-κB通路下游炎症因子,二者水平变化与机体炎症反应密切相关。本研究说明急性脑梗死大鼠脑组织出现一定程度的炎症反应,上调miR-145-5p表达能够调控TLR4/NF-κB通路蛋白表达,抑制下游炎症因子水平,减轻大鼠脑组织炎症反应严重程度,从而起到脑保护作用。

本研究推测由于上调miR-145-5p表达能够抑制大鼠脑组织神经细胞凋亡,从而发挥脑保护作用。急性脑梗死症状的发生发展伴随脑组织细胞凋亡、自噬是机体神经功能损伤的主要原因〔17,18〕。Bcl-2、Bax为线粒体凋亡通路的重要成员,二者表达变化与细胞增殖、凋亡能力变化密切相关〔19,20〕。LC3-Ⅱ、Beclin-1是常用的评价细胞自噬的指标,二者表达与细胞自噬密切相关〔21,22〕。本研究说明上调miR-145-5p表达能够调控细胞凋亡、自噬蛋白表达,抑制急性脑梗死大鼠脑组织细胞凋亡、自噬,具有一定的脑保护作用。