基于网络药理学和分子对接探讨四物汤治疗复发性流产的作用机制*

郭利,任梦雪,侯梓桐,陈紫薇,周琳,陈瑞雪

中国中医科学院广安门医院,北京 100053

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指与同一性伴侣发生两次及以上孕24周内的妊娠丢失[1],困扰着1%～5%的育龄期女性[2]。RSA与多种因素相关,但临床上仍约50%的患者病因不明[3],临床诊疗棘手,是目前生殖医学亟待解决的热点难题之一。研究表明,既往多次流产史是产科并发症的高危因素,RSA患者具有更高罹患心血管疾病、静脉血栓栓塞性疾病的风险,甚至与过早死亡存在相关性[4-5],因此防治RSA具有重要的临床和社会意义。中医学将RSA归属于“滑胎”“数堕胎”“屡孕屡堕”等范畴,认为母体冲任损伤、胎元不固是其主要病机,临床多从肾虚、脾肾虚弱、气血两虚、血热和血瘀等角度论治[6]。基于“治未病”和“预培其损”理念,中医药通过孕前干预在提高RSA患者再次妊娠率和保胎成功率方面具有显著而独特的优势。四物汤出自《仙授理伤续断秘方》,由熟地黄、当归、白芍、川芎组成,功专补血养血活血,为妇科调经、种子的基础方,被誉为“补血第一方”“妇科第一方”。导师陈瑞雪教授长期从事RSA相关临床研究,常以气血立论,擅长以四物汤为基础方加减防治RSA,临床疗效显著[7],但其作用机制尚不明确,临床推广应用较为局限。本文通过网络药理学和分子对接探讨四物汤治疗RSA的活性成分、核心靶点及信号通路,初步揭示其内在机理,为进一步实验研究指明方向。

1 资料与方法

1.1 搜集四物汤活性成分及作用靶点在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中检索熟地黄、当归、白芍、川芎的化学成分,并设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18,搜集有效活性成分及作用靶点,再通过Cytoscape3.9.0绘制四物汤“活性成分-作用靶点”网络图。

1.2 筛选RSA相关靶点及四物汤治疗RSA的潜在靶点在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org)和Genecards(https://www.genecards.org)数据库中检索“recurrent spontaneous abortion” “RSA”等关键词获取疾病靶点,其中Genecards数据库靶点筛选条件为Score值大于中位数,将两个数据库检索结果合并去重得到RSA相关靶点。将RSA相关靶点与四物汤活性成分相关靶点导入Venn Diagram,获得四物汤与RSA的共同靶点,即为四物汤治疗RSA的潜在靶点。

1.3 构建PPI网络在STRING数据库(https://string-db.org)中设定“Homo Sapiens”“medium confidence>0.4”,构建共同靶点的PPI网络,再通过CytoScape3.9.0可视化展示并筛选核心靶点。

1.4 富集分析将共同靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析,通过微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)以气泡图形式展示结果。

1.5 分子对接通过PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取主要活性成分的3D结构式,并运用Open Babel软件将其转化为mol2格式。在PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载关键靶点蛋白结构式,并运用Pymol、AutoDock Tools1.5.7软件处理蛋白,最后使用AutoDock4进行分子对接,Pymol软件将对接结果可视化。

2 结果

2.1 四物汤活性成分及作用靶点基于TCMSP获得四物汤活性成分24个,对应242个作用靶点,合并去重后活性成分共20个,作用靶点103个,见表1。将结果导入Cytoscape3.9.0软件,绘制四物汤“活性成分-作用靶点”网络图,见图1,该网络由121个节点和260条边组成。根据Network Analyzer计算Degree值,排名前6位的活性成分为β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、杨梅素、谷甾醇、(+)-儿茶素,见表2。

注:圆形为药材;六边形为活性成分,其中A1、B1、C1为共有成分;菱形为作用靶点;SDH:熟地黄;DG:当归;BS:白芍;CX:川芎。

表1 四物汤组方中药活性成分及作用靶点数目

表2 四物汤排名前6位的活性成分

2.2 RSA相关靶点从Genecards数据库检索出 2 481 个RSA靶点,其中Score值中位数为3.01,故筛选分值大于3.01的靶点与OMIM数据库筛选的靶点合并去重,最终获取1539个RSA相关靶点。通过Venn Diagram共获得64个共同靶点,见图2。

图2 四物汤与RSA靶点韦恩图

2.3 共同靶点PPI网络将 64个共同靶点导入STRING数据库获取PPI信息,再运用CytoScape 3.9.0进行可视化,见图3,图中的64个节点代表蛋白质,516条边代表蛋白质之间的相互作用关系。根据Network Analyzer共获得12个核心靶点,以柱状图可视化展示,见图4。

图3 共同靶点PPI网络图

图4 PPI核心靶点

2.4 GO和KEGG富集分析运用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。GO功能富集分析共获得283个生物过程(biological processes,BP)、32个细胞组分(cellular components,CC)及74个分子功能(molecular functions,MF)。其中BP主要涉及调节细胞对多种化合物的应答,如雌二醇(response to estradiol)、脂多糖(response to lipopolysaccharide)、肿瘤坏死因子(response to tumor necrosis factor)等,调控平滑肌细胞的增殖(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)及血管生成(angiogenesis)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜腔(caveola)、细胞外间隙(extracellular space)等;MF在酶结合(enzyme binding)、蛋白质结合(protein binding)、类固醇结合(steroid binding)等方面较为显著。KEGG富集分析共获得88条信号通路,主要涉及癌症(pathways in cancer)、乙型肝炎(hepatitis B)、结核(tuberculosis)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路等,而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、细胞凋亡(apoptosis)、缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)、Toll样受体(Toll-like receptor)等信号通路也表现出较高的显著性。最后通过微生信平台将结果可视化处理,见图5—图8。

图5 GO功能富集分析(BP)

图6 GO功能富集分析(CC)

图7 GO功能富集分析(MF)

图8 KEGG信号通路富集分析

2.5 分子对接通过VLOOKUP函数将四物汤活性成分及作用靶点与共同靶点相对应,以获取四物汤关键活性成分,排名前4位的活性成分为山柰酚、β-谷甾醇、杨梅素、豆甾醇。将PPI核心靶点中排名前6位的靶点蛋白白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)(1ALU)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(7JRA)、蛋白激酶1(protein kinase1,AKT1)(4GV1)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)(1GWQ)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3)(5IBP)、前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)(5KIR)分别与4个关键活性成分进行分子对接,以考察四物汤治疗RSA的活性成分与关键靶点之间的结合模式及结合能力强弱。分子对接显示,除CASP3与山柰酚外,活性成分与关键靶点之间的结合能均<-5 kcal·mol-1,表明两者结合活性较好[8],见表3。其中,TNF与 β-谷甾醇、PTGS2与豆甾醇的结合活性尤为突出,IL-6与山柰酚形成氢键最多,用Pymol软件将其对接结果可视化,见图9。

图9 四物汤活性成分与部分关键靶点对接模式图

表3 分子对接结合能 (kcal·mol-1)

3 讨论

《景岳全书·妇人规》云:“妇人所重者在血,血能构精,胎孕乃成”[9],《傅青主女科》载:“精满则子宫易于摄精,血足则子宫易于容物”[10],皆强调精血充足是正常妊娠的必要条件。妇人以血为本,精血同源,RSA患者屡孕屡堕往往耗伤肾精而致阴血不足。加之患者多伴焦虑、抑郁情绪,肝失疏泄,日久化火而暗耗阴血,阴血愈加不足,因此补血养血是治疗RSA的重要思路。四物汤是补血养血兼活血行血的经典方剂,方中熟地黄大补肝肾精血;当归养血调经,还可补血活血,为妇科调经要药;白芍酸敛,可柔肝养肝,充养女子之先天;川芎活血祛瘀,行气止痛,为血中气药。诸药合用,使补血而不滋腻,行气而不伤血,临床以四物汤组方治疗妇科类疾病疗效显著。清代医家汪昂云:“凡血证,通宜四物汤”[11]。

为探究四物汤治疗RSA的潜在作用机制,本文运用网络药理学技术共获取四物汤活性成分20个,治疗RSA的靶点64个,并筛选出β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、杨梅素等关键活性成分,表明四物汤可能是通过这些活性成分对RSA发挥治疗作用。β-谷甾醇可通过下调Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、IL-1受体关联激酶1(IL-1 receptor associated kinase 1,IRAK1)的表达,抑制炎症信号通路关键分子的活化,减少分泌IL-6、TNF-α等炎性因子,起到抗炎作用[12]。山柰酚作为黄酮类化合物,其作用涉及抗炎、抗氧化、保护损伤组织等[13]。豆甾醇具有较强的抗氧化作用,还可能通过调控雌激素信号通路上丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)等表达,减少炎症反应[14]。杨梅素具有抗氧化、抑制炎症因子等作用,还可拮抗血小板活化因子,从而改善微循环,保护血管[15]。

通过PPI网络可以发现IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2等是四物汤治疗RSA的核心靶点,表明四物汤可能通过这些蛋白质保护妊娠。IL-6主要参与调节胚胎发育和妊娠过程中母胎界面免疫耐受功能[16],过低的IL-6不利于胎盘血管生成可致流产[17]。TNF可通过促进滋养细胞凋亡、兴奋子宫平滑肌收缩、激活机体凝血系统、激发母体与胚胎组织免疫排斥等导致流产发生[18]。研究表明,RSA患者血清组织呈现IL-6减少、TNF-α升高的特点[19]。AKT1主要参与血管生成、血管扩张和血管重构过程,可通过调节磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/AKT1信号通路促进母胎界面血管生成,降低流产率[20]。ESR1基因突变可通过改变血清雌激素水平影响妊娠,可能是URSA发病机制之一[21]。CASP3可通过促进滋养层细胞中的细胞凋亡导致RSA发生和发展[22]。PTGS2负责诱导产生前列腺素,而前列腺素可通过多种细胞过程促进母体免疫耐受,影响妊娠进程[23]。

对核心靶点进行GO功能富集分析发现,四物汤主要通过调节细胞应答、基因转录,调控平滑肌细胞的增殖及血管生成等生物过程对RSA发挥治疗作用。KEGG信号通路分析显示核心靶点参与的通路主要涉及RSA发病机制中的TNF、VEGF、HIF-1、Toll样受体等信号通路。VEGF可促进微血管通透性和血管生成,其表达下调与RSA关系密切[24]。HIF-1α能调节多种基因的表达,与血管形成、细胞凋亡等多种生物学效应相关,参与子宫内膜蜕膜化过程的调节,维持正常妊娠[25]。动物研究显示,RSA模型小鼠中HIF-1αmRNA及蛋白表达水平均下降[26]。Toll受体主要表达于免疫细胞,参与机体免疫反应,其异常表达可诱发母胎界面免疫排斥反应,导致反复妊娠丢失。研究发现,RSA患者蜕膜和血清组织中均存在TLR4高表达[27]。分子对接结果表明,四物汤关键活性成分山柰酚、β-谷甾醇、杨梅素、豆甾醇与核心靶点IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2的结合活性基本良好,在分子层面进一步验证了四物汤治疗RSA的潜在作用机制。

本研究结果提示,四物汤可能通过山柰酚、β-谷甾醇、杨梅素、豆甾醇等活性成分与IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2等核心靶点发生相互作用,通过调控TNF、VEGF、HIF-1、Toll样受体等多种信号通路,调节细胞凋亡与炎症反应、改善母胎界面免疫微环境以及促进血管生成,从而改善不良妊娠结局,提高妊娠成功率。但本研究结果是以分子大数据为基础的分子机制的探讨,今后尚需通过设计严谨的实验验证,以提高结论的科学性和准确性。