肌骨宁对去势大鼠骨质疏松及肌萎缩的保护作用研究*

桑继亮,马江涛

1.开封市第二中医院,河南 开封 475000; 2.河南省洛阳正骨医院,河南省骨科医院,河南 郑州 450003

骨质疏松症(osteoporosis,OP),是一种骨形成与骨吸收动态平衡紊乱的代谢性骨病,其特征是骨量降低、骨微结构破坏和骨脆性增加,由此引发的脆性骨折或骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture,OPF)不仅导致桡骨远端、腰椎和股骨颈骨折,还给家庭和社会带来沉重的心理负担和经济负担[1]。中国骨质疏松症流行病学调查报告指出,我国50岁以上人群OP患病率为19.2%,男女比例为15;65岁以上人群OP患病率为32.0%,男女比例为15[2]。肌少症(sarcopenia,SP)是以肌力、肌量和肌肉功能的渐进性和全身性下降为特征的全身性肌肉疾病,SP引起患者跌倒、骨折、住院、致残和致死风险增加。由于SP诊断标准不一,其发病率范围为8.55%～36.50%[3]。OP常常合并SP,到底是OP引起SP,还是SP引起OP,或者两者同时发病,目前尚无定论。目前,国内外学者已开始关注骨质疏松合并肌少症,即肌少-骨质疏松症(osteosarcopenia,OS),然而受限于缺乏成熟的体内模型,本病的基础研究一直无法广泛开展。去势模型(ovariectomy,OVX)是国内外研究绝经后OP的“金标准”,也是FDA和WHO推荐的研究绝经后OP的最佳模型,已被广泛应用[4-5]。众多研究表明,骨质疏松和肌萎缩之间存在复杂联系[6-9],废用性OP模型也表现出肌萎缩[10-11]。然而去势模型除了骨质疏松,是否也能出现肌萎缩目前尚不清楚。本研究通过构建大鼠去势模型并进行药物干预,研究去势对大鼠骨骼和肌肉的影响,以及肌骨宁对去势大鼠骨质疏松及肌萎缩的保护作用。

1 材料

1.1 动物SPF级6月龄雌性SD大鼠60只,体质量300～350 g,购于河南省实验动物中心,动物合格证号:SCXK(豫)2017-0001。动物实验方案经河南省洛阳正骨医院动物实验伦理委员会批准(批准号:KY2021-003-01)。大鼠于SPF级实验室饲养,温度(23±3)℃,湿度(50±10)%,每天光照 12 h,喂食普通饲料及无菌用水。

1.2 药品和试剂肌骨宁(杜仲、菟丝子、黄芪、丹参、甘草)水煎剂由河南省洛阳正骨医院中药房提供;戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司,批号:国药准字J20171038,规格:1 mg);氯化钠注射液(广西裕源药业有限公司,批号:国药准字H19010205);注射用青霉素钠(山东鲁抗医药股份有限公司,批号:国药准字H37020080)。40 ng·L-1多聚甲醛(兰杰柯科技有限公司,货号:BL539A);无水乙醇(上海科醚化学科技有限公司,货号:C007983);新型脱钙液(北京索莱宝科技有限公司,货号:E1171);苏木素伊红染液(上海碧云天生物技术有限公司,货号:C0105M);大鼠血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)ELISA检测试剂盒(上海沪鼎生物,货号:D-30037);大鼠血清I型前胶原氨基端肽(type I procollagen amino terminal peptide,PINP)、I型胶原交联羧基末端肽(type I collagen cross-linked carboxy terminal peptide,β-CTx)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)、雌二醇(estradiol,E2)ELISA检测试剂盒(武汉酶免生物科技有限公司,货号:MM-20710R1、MM-20172R1、MM-0197R1、MM-0575R1)。

1.3 仪器BSA124S型分析天平(德国赛多利斯集团);YLS-13A型大小鼠抓力测定仪(济南益延科技发展有限公司);Discovery A型双能X线骨密度仪(美国Hologic公司);micro CT仪(瑞士Scanco Medical公司);JJ-12J型脱水机、JB-P5型包埋机(武汉俊杰电子有限公司);RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);KD-P型组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司);CX43型正置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药60只雌性SPF级SD大鼠适应性饲养1周后,按随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组、肌骨宁组和雌激素组。除正常组及假手术组外,其余大鼠采用去势法切除双侧卵巢,假手术组切除卵巢附近等量脂肪组织,逐层缝合肌肉和皮肤,术后每只大鼠肌肉注射青霉素钠8万单位,每天1次,连续3 d。造模3个月后,进行药物干预,给药剂量按照人与大鼠体表面积折算,肌骨宁给药剂量为2.083 g·kg-1·d-1,雌二醇给药剂量为0.104 mg·kg-1·d-1,即肌骨宁组大鼠每天灌胃给予2.083 g·kg-1肌骨宁水煎剂,雌激素组大鼠每天灌胃0.104 mg·kg-1雌二醇溶液,其余组大鼠每天灌胃等体积的生理盐水,灌胃体积为 10 mL·kg-1,连续灌胃3个月。

2.2 大鼠抓力检测分别在造模前、用药前和取材前测量大鼠前爪抓力。使用大小鼠抓力仪每周定时测量大鼠前爪抓力(forelimb grip strength)。测试前让大鼠在抓力仪上适应3 min,然后快速抓住鼠尾,待大鼠前爪抓牢后,沿鼠尾轻轻地水平向后拉,使后肢悬空,连续测量3次,记录仪器最大抓力读数,用三次抓力的平均值反映前爪肌肉力量。

2.3 取材及相关脏器质量检测麻醉大鼠后,腹主动脉采血,离心机分离血清,超低温冰箱冻存。完整分离左侧股骨、腓肠肌、比目鱼肌、子宫、肝脏和肾脏等组织,剔除周围组织,预冷PBS漂洗,吸水纸吸去表面水分,分析天平分别称取子宫、肝脏和肾脏的质量。称质量后放入10 mL离心管中,多聚甲醛固定。

2.4 双能X线骨密度仪检测麻醉大鼠后,用双能X线骨密度仪“小动物”模式中“大鼠全身”和“区域高分辨率”分别测量大鼠全身骨密度(bone mineral density,BMD)、股骨BMD、瘦肉量、脂肪量、骨矿量和四肢瘦肉量等,计算大鼠全身骨矿含量(全身骨矿含量/体质量,bone mineral content,BMC)和脂肪含量百分比(全身脂肪含量/体质量,fat content,FAT)。根据多个肌少症工作组制订的标准[12-15],计算大鼠骨骼肌质量指数(全身骨骼肌量/体质量,skeletal mass index,SMI)和相对骨骼肌质量指数(四肢骨骼肌量/体质量,RSMI)。

2.5 micro CT检测对离体股骨进行micro CT扫描,扫描条件设定为电压80 KV,电流100 μA,扫描厚度为14 μm。通过仪器自带分析软件(CTAn)框取松质骨,选择股骨远端生长板上方1 mm的松质骨作为感兴趣区,分析骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV)、骨表面密度(bone surface density,BS/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁数(trabecular number,Tb.N)和骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp),并通过仪器自带分析软件(CTvox)重构股骨远端三维图像。

2.6 大鼠血清学检测根据ELISA试剂盒说明,采用ELISA法检测大鼠血清AKP、PINP、β-CTx、IGF-1、E2含量。

2.7 病理染色股骨远端和腓肠肌先后进行HE染色,显微镜下观察股骨远端和腓肠肌的病理变化。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况比较实验过程中,假手术组大鼠因术后伤口感染死亡1只,肌骨宁组大鼠因灌胃刺伤呼吸道死亡2只,最终纳入研究的动物数量为57只。各组大鼠行为活动正常,毛发光泽干净,饮食饮水正常,分泌物及二便正常。

3.2 各组大鼠子宫、肝脏和肾脏质量比较对各组大鼠的子宫、肝脏和肾脏质量检测发现,模型组、肌骨宁组和雌激素组大鼠的子宫质量较正常组和假手术组降低,差异有统计学意义(P<0.05);而各组肝脏、肾脏质量无明显变化,表明去势可显著引起大鼠子宫萎缩,而对肝脏和肾脏无影响,证明模型构建成功。见图1。

注:A:肝脏质量比较;B:肾脏质量比较;C:子宫质量比较;与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与模型组比较,cP<0.05。

3.3 各组大鼠体成分比较与正常组和假手术组比较,模型组大鼠的BMC下降,FAT增加,差异均具有统计学意义(P<0.05),表明去势可引起大鼠骨矿含量下降,脂肪含量增加。与模型组比较,肌骨宁和雌激素可增加去势大鼠BMC,降低FAT,差异均具有统计学意义(P<0.05),表明肌骨宁和雌激素均可增加去势大鼠BMC、降低FAT,调节大鼠体成分变化。见图2。

注:A:BMC水平比较;B:FAT水平比较;与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与模型组比较,cP<0.05。

3.4 各组大鼠体质量及抓力比较分别在造模前、用药前和取材前对各组大鼠体质量及前爪抓力进行测量,发现各组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)。造模前,各组大鼠前爪抓力差异无统计学意义(P>0.05);取材前,肌骨宁组和雌激素大鼠组的前爪抓力较模型组有增加趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),表明肌骨宁和雌激素有增加去势大鼠前爪抓力的趋势。见图3。

注:A:各组大鼠体质量的连续性比较;B:各组大鼠取材前体质量比较;C:各组大鼠前爪抓力的连续性比较;D:造模前、取材前各组大鼠前爪抓力比较。

3.5 各组大鼠骨骼肌质量指数和相对骨骼肌质量指数比较与假手术组比较,模型组大鼠SMI和RSMI下降,差异有统计学意义(P<0.05),表明去势可导致大鼠骨骼肌萎缩。与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠SMI和RSMI增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明肌骨宁和雌激素防治去势导致的大鼠骨骼肌萎缩。见图4。

注:A:各组大鼠四肢感兴趣区;B:各组大鼠SMI比较;C:各组大鼠RSMI比较;与假手术组比较,bP<0.05;与模型组比较,cP<0.05。

3.6 各组大鼠骨密度比较与正常组和假手术组比较,模型组大鼠全身BMD和股骨BMD下降,差异有统计学意义(P<0.05),表明去势大鼠发生骨质疏松。与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠全身BMD和股骨BMD增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明肌骨宁和雌激素均可防治去势引起的骨质疏松。见图5。

注:A:全身BMD水平比较;B:股骨BMD水平比较;与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与模型组比较,cP<0.05。

3.7 各组大鼠股骨骨微结构比较与正常组和假手术组比较,模型组大鼠股骨BV/TV、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N降低,Tb.Sp明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),表明股骨远端骨小梁稀疏,体积减小,骨小梁数目和厚度明显下降,骨小梁分离度明显增加,股骨远端发生骨质疏松。与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠股骨BV/TV、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N增加,Tb.Sp下降,差异具有统计学意义(P<0.05),表明肌骨宁和雌激素明显增加骨小梁体积、数目和厚度,减小骨小梁分离度,防治OP,这与股骨远端三维重建结果相一致。见图6—图7。

注:A:BV/TV水平比较;B:BS/BV水平比较;C:BS/TV水平比较;D:Tb.Th水平比较;E:Tb.Sp水平比较;F:Tb.N水平比较;与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与模型组比较,cP<0.05。

3.8 大鼠血清学检测与正常组和假手术组比较,模型组大鼠血清骨形成标志物AKP、IGF-1和E2水平下降,骨吸收标志物β-CTx水平增加,差异具有统计学意义(P<0.05),表明去势可抑制大鼠骨形成,促进骨吸收。与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠血清骨形成标志物AKP、IGF-1和E2水平增加,骨吸收标志物β-CTx水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),表明肌骨宁和雌激素抑制去势大鼠的骨吸收,促进骨形成,防治去势大鼠的骨质疏松。见图8。

注:A:AKP水平比较;B:β-CTx水平比较;C:TGF-1水平比较;D:E2水平比较;与正常组比较,aP<0.05;与假手术组比较,bP<0.05;与模型组比较,cP<0.05;与肌骨宁组比较,dP<0.05。

3.9 各组大鼠腓肠肌和股骨病理染色比较

3.9.1 股骨HE染色与正常组和假手术组比较,模型组大鼠股骨骨小梁数量明显减少,厚度下降,连续性中断,分离度增加,骨髓脂肪化严重。与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠股骨骨小梁数量明显增加,厚度增加,分离度减小,骨髓脂肪化减轻,表明肌骨宁和雌激素均可防治骨质疏松。见图9。

图9 各组大鼠股骨HE染色比较(×200)

3.9.2 腓肠肌HE染色与正常组和假手术组比较,模型组大鼠腓肠肌肌纤维排列紊乱,肌间隙增宽,肌纤维萎缩,肌细胞核皱缩减小。与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠腓肠肌肌纤维排列紧密,肌间隙减小,肌纤维增粗,肌细胞核增多增大,表明肌骨宁和雌激素均可防治肌萎缩。见图10。

图10 各组大鼠腓肠肌HE染色比较(×200)

4 讨论

中医认为OP属 “骨痿”“骨枯”“骨痹”等范畴,肾虚是根本,肾精充盛,骨髓充盈,则骨骼强壮有力;脾虚血瘀,运化无力,血瘀气滞,肾精不足以充养骨髓,则发为本病。“补肾健脾活血”是防治OP及OPF的主要治疗原则。中医认为SP属 “肉痿”范畴,脾虚肉萎。脾肾亏虚,骨枯肉萎[16-19]。肌骨宁由马江涛博士领衔研发,从系统药理学、中药药理学、体内外实验等多方面深入研究,经过反复组方分析,研制而成。全方共五味中药,包括杜仲、菟丝子、黄芪、丹参和甘草。针对OP“肾虚脾虚血瘀”的病机,方中杜仲、菟丝子补肾壮骨,黄芪补气健脾,丹参补血活血,甘草调和诸药,共凑补肾健脾活血、壮骨强肌止痛之功效。组方精简,效果显著,已被制成膏方广泛用于临床。

去势模型是研究绝经后OP的“金标准”,去势引起骨质疏松已经毋庸置疑,然而去势能否引起肌萎缩目前报道较少。国外学者将5月龄和10月龄的SD大鼠分成假手术组和去势组并分别配对喂养,发现10月龄的SD大鼠发生骨质疏松和肌肉萎缩[20]。本研究表明,与正常组和假手术组比较,模型组大鼠全身BMD和股骨BMD明显下降,股骨远端骨小梁稀疏,数量减小,厚度下降,分离度增加,骨髓脂肪化加重,血清骨形成标志物下降,骨吸收标志物增加,表明OVX大鼠发生骨质疏松。除了骨质疏松,OVX大鼠也明显发生骨骼肌萎缩。与正常组和假手术组比较,模型组大鼠SMI和RSMI明显下降,腓肠肌肌纤维排列紊乱,肌纤维间结缔组织增生,肌核明显皱缩,肌肉脂肪化严重,表明OVX大鼠发生肌萎缩。可见,去势不仅引起大鼠骨质疏松,而且引起大鼠肌萎缩。

目前OP治疗仅限于“抗骨质疏松”,而忽视了骨质疏松可能伴随肌萎缩,能否使用中药同时防治骨质疏松和肌萎缩呢?本研究进一步运用中药肌骨宁干预OVX大鼠模型,明确肌骨宁对骨质疏松和肌萎缩的防治作用。研究表明,与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠全身BMD和股骨BMD明显提高,股骨远端骨小梁数量增加,厚度增加,分离度减小,骨髓脂肪化减轻,血清骨形成标志物增加,骨吸收标志物减少,提示肌骨宁和雌激素可防治去势大鼠的骨质疏松。除了防治骨质疏松,肌骨宁和雌激素也能防治肌萎缩。与模型组比较,肌骨宁组和雌激素组大鼠前爪抓力有增加趋势,SMI和RSMI明显增加,腓肠肌肌纤维排列紧密,肌纤维间结缔组织减少,肌核明显增大,肌肉脂肪化减轻,表明肌骨宁和雌激素均可防治肌萎缩。此外,长期使用E2的副作用包括胃部不适、恶心、头痛、体质量增加和子宫出血,甚至会增加子宫内膜癌的发病率。与E2比较,肌骨宁更便宜,副作用更少。因此,许多患者可能更容易接受肌骨宁。总之,肌骨宁和E2均能有效改善OS大鼠的骨骼和肌肉表型,尽管仍需要大量高质量的随机对照试验研究来验证,但肌骨宁和E2可能是治疗OS的潜在药物。

本研究发现去势引起大鼠骨质疏松和肌萎缩,肌骨宁和雌激素均能防治骨质疏松和肌萎缩。根据上述研究,结合国内外报道[7,21-23],认为骨质疏松和肌萎缩之间存在生理病理上的联系,两者可能有共同的调控机制。肌肉和骨骼位置毗邻,肌肉为骨骼运动提供动力来源,骨骼为肌肉生长提供物理支撑;肌肉除牵拉刺激骨细胞生长外,还可作为内分泌器官分泌骨因子,促进骨细胞生长;骨骼也可作为内分泌器官分泌骨因子,刺激肌细胞增长。肌肉和骨骼在生物力学稳态、内分泌稳态、基因作用等方面存在复杂深入的关系,因此研究者称其为“肌骨串扰”[24-26]。有研究认为,GH/IGF-1/PI3K/Akt信号通路与两者的发病密切相关[7],其中雌激素、睾酮、生长激素和IGF-1可能起到重要作用。骨质疏松和肌萎缩患者中较低的维生素D水平可能与两者的发病相关[27]。研究认为,骨骼肌Akt1/2基因缺失导致小鼠OS发病,并引起小鼠寿命缩短[28]。有研究认为,骨质疏松和肌萎缩两者经常同时存在[9,29-31],称之为OS,OS患者跌倒、骨折、住院、残疾和死亡风险远高于仅患骨质疏松或肌少症者,并且发病机制复杂。本研究也证实,合成代谢类激素IGF-1和E2在OVX大鼠模型中含量明显变低,药物干预后明显增加,合成代谢类激素可能和OS的生理病理相关。

无论是骨质疏松,还是肌萎缩,甚至是肌少—骨质疏松症,单单“从骨论治”已经明显不妥,“肌骨同治”才是最佳选择。肌骨宁基于OP“肾虚脾虚血瘀”病机,“肌骨同治”,强肌壮骨,为骨质疏松合并肌萎缩患者提供了中医方案。