臭草二氯甲烷部位化学成分研究

江 程,方 晒,李远文,吴伟东,陈瑞云,顾 琼

1深圳技师学院,深圳 518116;2中山大学药学院药物分子设计研究中心,广州 510006

芸香草为芸香科植物臭草RutagraveolensL.的全草,多年生草本植物,有强烈气味,又名臭艾(《广西中药志》)、小香草(《广西植物名录》)、荆芥七(《广西中草药》)。盛夏采摘,阴干,全草可入药,枝叶可以煮食(《本草刚草部》)。性寒,味苦、辛,有祛风,退热,利尿,活血,解毒,消肿等作用。用于感冒发热、风湿骨痛、小儿惊风、小便不利、泄泻、疝气、跌打损伤、热毒疮疡、湿疹等[1]。研究发现臭草中富含香豆素、生物碱、黄酮、木质素以及多酚类等成分[2],已有的活性研究表明臭草具有解痉挛、抗肿瘤、抗菌以及抗生育等活性[3]。基于对清热解毒植物的抗病毒作用调研,发现臭草的95%乙醇提取物具有明显的体外抑制EB病毒DNA裂解复制的活性,因此,为了寻找抗EB病毒活性成分,我们利用活性导向分离方法,发现活性成分存在于二氯甲烷萃取部位,并对这一组分进行了系统的化学成分研究。以期阐明臭草抗EBV的药效物质基础,为进一步开发利用其药用价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

AM-400型核磁共振仪(Brucker公司);Agilent 1200型HPLC;Zorbax SB-C-18色谱柱(分析柱4.6 mm × 250 mm,5 μm;半制备柱9.4 mm × 250 mm,5 μm);柱色谱硅胶(200～300目);薄层色谱硅胶G;硅胶GF254(青岛海洋化工厂);反相填充材料C-18、Rp-18(Merck公司);Sephadex LH-20凝胶(Pharmacia公司);显色剂为5%硫酸-乙醇溶液。

P3HR1细胞(来自中山大学中山医学院人类病毒学实验室)。

RPIM1640(批号:E500026-0500,BR,生工生物股份有限公司);胎牛血清(批号:E510008-0100,BR,生工生物);青霉素-链霉素溶液(批号:B540732-0010,青霉素10 kU/mL,链霉素10 mg/mL,无菌,生工生物股份有限公司);右旋芸香苦素(批号:WKQ-0005734,HPLC纯度:98%,四川省维克奇生物科技有限公司);Tetradecanoyl phorbol acetate(TPA,批号:16561-29-8,AR,生工生物股份有限公司);丁酸钠(批号:A510838-0025,AR,生工生物股份有限公司);DMSO(批号:A503039-0250,AR,生工生物股份有限公司);LightCyclerFastStart DNA MasterPlus SYBR green试剂盒(批号:D601045-0001,生工生物股份有限公司)。

本研究所用臭草新鲜枝叶2019年采自广东省中山市,并由中国科学院昆明植物研究所韩春艳博士鉴定为RutagraveolensL.的全草,标本存放于中山大学药学院药物设计实验室,标本编号20190423012。

1.2 提取与分离

将新鲜的臭草枝叶(10 kg)风干,切碎后用95%乙醇室温下浸提三次(3 × 20 L),每次24 h。浸提液合并后减压浓缩至浸膏状。将得到的浸膏(0.85 kg)用适量水(1 L)混悬后,依次用二氯甲烷(3 × 4 L)和正丁醇(3 × 4 L)萃取,然后分别浓缩得到二氯甲烷部分浸膏(275 g)和正丁醇部分浸膏(220 g),把这两个部位用于抗EBV活性平台测试,二氯甲烷部分显示了较好的活性,接着对二氯甲烷部位进行了系统的分离。二氯甲烷部分用1.5倍硅胶拌样装柱后,以石油醚-乙酸乙酯(1∶0、100∶1、20∶1、9∶1、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1)梯度洗脱得到6个部分(A～F)。将B部分过MCI CHP20P色谱柱,以甲醇-水(30%→100%)梯度洗脱分别得到3个小组分(B1～B3)。3个小组分经过多次正向硅胶柱层析(以石油醚-氯仿体系冲洗)后得到6个化合物17(800 mg)、18(3.2 g)、19(286 mg)、20(160 mg)、27(320 mg)、28(432 mg)。C部分采用反相柱(C-18)分离,并以甲醇-水(30%→90%)梯度洗脱得到4个组分(C1～C4),经过硅胶柱进一步分离,最后利用凝胶、制备薄层板纯化,最终得到化合物1(420 mg)、2(16 mg)、3(28 mg)、4(220 mg)、10(32 mg)、11(12 mg)、12(55 mg)、13(26 mg)、21(134 mg)和22(44 mg)。D部分先利用硅胶柱以二氯甲醇20∶1进行细化段以及除去部分色素,各细分段再先后经过正相硅胶柱层析、凝胶的分子筛作用,以及析晶,最终得到化合物5(18 mg)、9(14 mg)、14(3 g)、15(116 mg)、16(224 mg)、24(30 mg)和25(23 mg)。E部分先过中压反相柱(RP-18),以(30%→100%)甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱,再经过凝胶柱(甲醇冲洗),最后利用高效液相(甲醇-水30∶70)得到化合物6(500 mg)、7(360 mg)、8(886 mg)、26(4.8 mg)。F部分同样显示利用反相柱细分段,再结合硅胶柱富集目标点,最后利用凝胶以及制备薄层层析色谱纯化,得化合物23(13.5 mg)、29(12 mg)和30(7.3 mg)。

1.3 抗EBV活性筛选

体外培养P3HR-1细胞(原发性渗出性淋巴瘤细胞系,含有潜伏感染期的EBV)。使用含有10%血清、链霉素(100 μg/mL)-青霉素(100 U/mL)溶液的RPMI1640培养基,在37 ℃,5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。调整对数生长期P3HR-1细胞密度为3×105个/mL,使用20 ng/mL的12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)和丁酸钠(0.3 mmol/L)诱导P3HR-1细胞进入裂解复制期。使用DMSO将待测粗提物分别配置不同浓度药物溶液。P3HR-1细胞经TPA处理3 h后,对细胞进行不同浓度的化合物处理,每个浓度设3个平行复孔,并设不进行TPA诱导和不经化合物处理的对照组进行比较。P3HR1细胞经TPA诱导2 d后收集细胞,提取细胞的总DNA,应用实时定量PCR技术,用Light Cycler Fast Start DNA Master Plus SYBR green试剂盒、EBNA1引物(正向:5′-CATTGAGTCGTCTCCCCTTTGGAAT-3′;反向:5′-TCATAACAAGGTCCTTAATCGCA TC-3′)和GAPDH引物分别检测上述细胞总DNA中EBNA1和GADPH的拷贝数,并计算EBNA1/GADPH相对比值。化合物测试结果用IC50值表示,细胞毒性(CC50)在给细胞加化合物2 d后测试,右旋芸香苦素为阳性对照组。

按公式(1)计算各化合物在不同浓度下的EBV裂解复制相对抑制数,以EBV相对抑制数为纵坐标,药物浓度为横坐标绘制各化合物对EBV裂解复制的抑制曲线图,并计算各药物的复制半数抑制剂量(IC50)以评价各化合物对EBV裂解复制的抑制活性。按公式(2)计算各化合物不同浓度下的相对毒性和半数致死剂量(CC50),用于评价各化合物的细胞毒性。按照公式(3)计算各化合物的选择性常数(selective index,SI),以评价各化合物的用药安全性。

EBV裂解复制相对抑制数 = [(TPA诱导且加

化合物组EBNA1/GAPDH)-(仅加化合物组

EBNA1/GAPDH)]/[(TPA诱导但不加化合物组

EBNA1/GAPDH)-(不诱导且不加化合物组EBNA1/

GAPDH)]

(1)

相对毒性 =

[1-(加化合物组OD)/(不加化合物组OD)]×100%

(2)

SI = CC50/IC50

(3)

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1黄色粉末;ESI-MS:m/z286 [M+H]+,分子式为C16H15NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:15.0(1H,br s,1-OH),8.43(1H,d,J= 8.0 Hz,H-8),7.86(1H,dd,J= 8.8,7.4 Hz,H-6),7.59(1H,d,J= 8.8 Hz,H-5),7.39(1H,dd,J=8.0,7.4 Hz,H-7),6.27(1H,s,H-4),4.19(3H,s,2-OCH3),4.15(3H,s,3-OCH3),3.88(3H,s,N-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:155.7(s,C-1),129.9(s,C-2),159.1(s,C-3),86.7(d,C-4),114.5(d,C-5),133.7(d,C-6),121.2(d,C-7),126.0(d,C-8),180.4(s,C-9),140.1(s,C-11),105.3(s,C-12),120.3(s,C-13),141.6(s,C-14),60.6(q,2-OCH3),55.8(q,3-OCH3),33.8(q,N-CH3)。以上数据与文献[4]报道基本一致,故鉴定化合物1为山小橘碱。

化合物2黄色粉末;ESI-MS:m/z344 [M+H]+,分子式为C19H21NO5;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.24(1H,dd,J= 8.1,2.0 Hz,H-8),7.54(1H,td,J= 8.5,8.1 Hz,H-6),7.23(1H,dd,J= 8.5,2.0 Hz,H-5),7.16(1H,td,J= 8.5,8.1 Hz,H-7),4.47(1H,q,J= 6.8 Hz,H-15),3.88(6H,s,1,4-OCH3),3.49(3H,s,N-CH3),1.35(6H,d,J= 6.8 Hz,16,17-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:148.6(s,C-1),135.4(s,C-2),146.8(s,C-3),132.6(s,C-4),115.8(d,C-5),133.2(d,C-6),122.2(d,C-7),126.3(d,C-8),176.4(s,C-9),113.7(s,C-11),135.0(s,C-12),123.4(s,C-13),144.5(s,C-14),76.0(d,C-15),22.1(q,C-16,17),60.5(q,1-OCH3),60.8(q,4-OCH3),41.6(q,N-CH3)。以上数据与文献[5]报道基本一致,故鉴定化合物2为2-羟基-3-异丙氧基-1,4-甲氧基-10-甲基吖啶酮。

化合物3黄色粉末;ESI-MS:m/z308 [M+H]+,分子式为C19H17NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:15.20(1H,s,1-OH),8.21(1H,dd,J= 8.0,1.2 Hz,H-8),7.58(1H,m,H-6),7.23(1H,br d,J= 8.4 Hz,H-5),7.13(1H,m,H-7),6.09(1H,s,H-2),5.11(1H,m,H-2),5.10(1H,m,H-4),4.95(1H,m,H-4),3.80(3H,s,N-CH3),3.59(2H,m,H-1),1.78(3H,s,19-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:165.3(s,C-1),91.6(d,C-2),166.8(s,C-3),100.7(s,C-4),115.8(d,C-5),134.3(d,C-6),121.6(d,C-7),125.3(d,C-8),180.0(s,C-9),143.3(s,C-11),105.1(s,C-12),120.0(s,C-13),142.3(s,C-14),37.6(t,C-15),85.8(d,C-16),143.4(s,C-17),112.4(t,C-18),16.9(q,C-19),35.9(d,N-CH3)。以上数据与文献[6]报道基本一致,故鉴定化合物3为芸香日酮。

化合物4黄色粉末;ESI-MS:m/z256 [M+H]+,分子式为C15H13NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:14.72(1H,s,1-OH),8.33(1H,dd,J= 7.8,1.5 Hz,H-5),7.67(1H,m,H-6),7.36(1H,dd,J= 7.8,1.2 Hz,H-8),7.18(1H,m,H-7),6.17(2H,d,J= 1.6 Hz,H-2,4),3.80(3H,s,N-CH3),3.67(3H,s,3-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:165.0(s,C-1),93.1(d,C-2),165.3(s,C-3),88.9(d,C-4),113.5(d,C-5),133.0(d,C-6),120.4(d,C-7),125.7(d,C-8),180.0(s,C-9),141.0(s,C-11),103.9(s,C-12),120.0(s,C-13),143.7(s,C-14),54.5(q,3-OCH3),33.0(q,N-CH3)。以上数据与文献[7]报道基本一致,故鉴定化合物4为1-羟基-3-甲氧基-N-甲基吖啶酮。

化合物5黄色粉末;ESI-MS:m/z340 [M+H]+,分子式为C19H17NO5;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.64(1H,dd,J= 8.0,1.5 Hz,H-8),7.66(1H,ddd,J= 8.6,7.1,1.6 Hz,H-7),7.38(1H,d,J= 8.6 Hz,H-5),7.28(1H,t,J= 7.3 Hz,H-6),6.57(1H,s,H-2),5.47(1H,t,J= 9.0 Hz,H-16),4.52～4.41(2H,m,H-17),4.36(2H,d,J= 11.1 Hz,H-21),4.29～4.17(2H,m,H-22),3.77(3H,s,N-CH3);13C NMR(100 MHz,C5D5N)δ:166.0(s,C-1),92.9(d,C-2),168.1(s,C-3),101.7(s,C-4),115.7(d,C-5),134.1(d,C-6),121.8(d,C-7),126.5(d,C-8),181.5(s,C-9),106.8(s,C-11),144.0(s,C-12),121.6(s,C-13),143.2(s,C-14),85.7(d,C-15),32.8(t,C-16),76.0(s,C-17),47.6(t,C-19),62.9(t,C-20),38.0(q,N-CH3)。以上数据与文献[8]报道基本一致,故鉴定化合物5为羟甲基吖啶酮环氧化物。

化合物7黄色粉末;ESI-MS:m/z276 [M+H]+,分子式为C15H17NO4;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:8.08(1H,d,J= 9.0 Hz,H-9),7.94(1H,dd,J= 9.1,2.8 Hz,H-8),7.86(1H,d,J= 2.7 Hz,H-6),4.48(1H,t,J= 4.9 Hz,H-3),4.18(3H,s,N-CH3),3.38(2H,d,J= 4.8 Hz,H-4),1.83(3H,s,2-CH3),1.66(3H,s,2-CH3);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:81.7(s,C-2),67.2(d,C-3),25.7(t,C-4),174.5(s,C-5),116.8(d,C-6),152.7(s,C-7),108.4(d,C-8),120.6(s,C-9),132.1(s,C-10),124.4(s,C-11),153.9(s,C-12),95.3(s,C-13),24.9(q,2-CH3),20.1(q,2-CH3),30.1(q,N-CH3)。以上数据与文献[10]报道基本一致,故鉴定化合物7为(-)-日把里尼定。

化合物10黄色粉末;ESI-MS:m/z230 [M+H]+,分子式为C13H11NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.80(1H,dd,J= 9.0,2.5 Hz,H-5),7.52(1H,d,J= 2.8 Hz,H-2),7.34(1H,dd,J= 9.0,9.0 Hz,H-6),7.01(1H,dd,J= 9.0,2.5 Hz,H-7),6.97(1H,d,J= 2.8 Hz,H-3),4.35(3H,s,4-OCH3),4.05(3H,s,8-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:143.3(s,C-2),104.1(d,C-3),156.3(s,C-4),113.8(s,C-5),123.1(s,C-6),107.2(d,C-7),154.1(s,C-8),137.1(s,C-9),119.1(s,C-10),162.7(s,C-11),58.5(q,4-OCH3),55.5(q,8-OCH3)。以上数据与文献[12]报道基本一致,故鉴定化合物10为γ-fagarine。

化合物11黄色粉末;ESI-MS:m/z260 [M+H]+,分子式为C14H13NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.42(1H,s,H-5),7.33(1H,s,H-8),7.55(1H,d,J= 2.8 Hz,H-2),6.99(1H,d,J= 2.8 Hz,H-3),4.46(3H,s,4-OCH3),4.05(3H,s,6-OCH3),4.02(3H,s,7-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:142.4(s,C-2),104.5(d,C-3),155.7(s,C-4),100.4(d,C-5),152.6(s,C-6),147.9(s,C-7),106.7(d,C-8),142.7(s,C-9),102.3(s,C-10),163.1(s,C-11),113.1(d,C-12),58.8(q,4-OCH3),56.0(q,6,7-OCH3)。以上数据与文献[13]报道基本一致,故鉴定化合物11为香草木宁碱。

化合物12黄色粉末;ESI-MS:m/z246 [M+H]+,分子式为C13H11NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.07(1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),7.58(1H,d,J= 2.5 Hz,H-2),7.21(1H,d,J= 9.0 Hz,H-6),7.03(1H,d,J= 2.5 Hz,H-3),4.46(3H,s,8-OCH3),4.03(3H,s,4-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:142.5(s,C-2),104.7(d,C-3),157.3(s,C-4),118.8(d,C-5),114.2(d,C-6),138.6(s,C-7),140.7(s,C-8),149.0(d,C-9),101.7(s,C-10),164.1(s,C-11),114.5(s,C-12),58.7(q,4-OCH3),62.0(q,8-OCH3)。以上数据与文献[14]报道基本一致,故鉴定化合物12为合帕洛平。

化合物13黄色粉末;ESI-MS:m/z260 [M+H]+,分子式为C14H13NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.03(1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),7.58(1H,d,J= 2.5 Hz,H-2),7.23(1H,d,J= 9.0 Hz,H-6),7.05(1H,d,J= 2.5 Hz,H-3),4.46(3H,s,8-OCH3),4.16(3H,s,4-OCH3),4.07(3H,s,7-OCH3);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:142.8(d,C-2),104.6(d,C-3),157.1(s,C-4),118.1(d,C-5),111.8(d,C-6),142.0(s,C-7),141.1(s,C-8),152.1(s,C-9),101.8(s,C-10),164.3(s,C-11),114.8 (s,C-12),58.8(q,4-OCH3),56.7(q,7-OCH3),61.6(q,8-OCH3)。以上数据与文献[15]报道基本一致,故鉴定化合物13为茵芋碱。

化合物15白色粉末;ESI-MS:m/z255 [M+H]+,分子式为C16H14O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.68(1H,s,H-4),7.67(1H,d,J= 2.1 Hz,H-11),7.65(1H,s,H-5),7.43(1H,s,H-8),6.82(1H,d,J= 2.1 Hz,H-12),6.21(1H,dd,J= 17.7,10.3 Hz,H-14),5.15(1H,d,J= 5.8 Hz,H-15),5.08(1H,d,J= 5.8 Hz,H-15),1.52(6H,s,13-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:159.9(s,C-2),133.1(s,C-3),138.3(d,C-4),119.5(d,C-5),124.6(s,C-6),155.8(s,C-7),98.9(d,C-8),151.3(s,C-9),115.9(s,C-10),146.6(s,C-11),106.4(d,C-12),40.5(s,C-13),145.5(d,C-14),112.3(t,C-15),26.2(q,13-CH3),26.2(q,13-CH3)。以上数据与文献[17]报道基本一致,故鉴定化合物15为chalepensin。

化合物17白色粉末;ESI-MS:m/z217 [M+H]+,分子式为C12H8O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.79(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.69(1H,d,J= 2.1 Hz,H-11),6.95(1H,s,H-5),6.82(1H,d,J= 2.1 Hz,H-12),6.37(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.7(s,C-2),115.0(d,C-3),144.6(s,C-4),113.1(d,C-5),126.4(s,C-6),148.0(s,C-7),133.0(s,C-8),143.2(s,C-9),116.7(s,C-10),146.9(s,C-11),107.0(d,C-12),61.6(q,8-OCH3)。以上数据与文献[19]报道基本一致,故鉴定化合物17为花椒毒素。

化合物18白色粉末;ESI-MS:m/z187 [M+H]+,分子式为C11H6O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.81(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.70(1H,d,J= 2.4 Hz,H-11),7.69(1H,s,H-5),7.48(1H,s,H-8),6.76(1H,d,J= 2.4 Hz,H-12),6.38(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.1(s,C-2),114.7(d,C-3),144.0(d,C-4),119.8(d,C-5),124.9(s,C-6),156.4(s,C-7),99.9(d,C-8),152.1(s,C-9),115.4(s,C-10),146.9(s,C-11),106.4(d,C-12)。以上数据与文献[20]报道基本一致,故鉴定化合物18为补骨酯素。

化合物19白色粉末;ESI-MS:m/z217 [M+H]+,分子式为C12H8O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.15(1H,d,J= 9.8 Hz,H-4),7.59(1H,d,J= 2.4 Hz,H-9),7.13(1H,s,H-8),7.01(1H,d,J= 2.4 Hz,H-2),6.27(1H,d,J= 9.8 Hz,H-3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.2(s,C-2),112.6(d,C-3),139.2(d,C-4),149.5(s,C-5),112.7(s,C-6),158.3(s,C-7),93.9(d,C-8),152.7(s,C-9),106.4(s,C-10),144.7(s,C-11),105.0(d,C-12),60.1(q,5-OCH3)。以上数据与文献[13]报道基本一致,故鉴定化合物19为佛手柑内酯。

化合物20白色粉末;ESI-MS:m/z231 [M+H]+,分子式为C14H14O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.64(1H,d,J= 9.5 Hz,H-4),7.36(1H,d,J= 8.6 Hz,H-5),6.85(1H,dd,J= 8.6,2.3 Hz,H-6),6.82(1H,d,J= 2.3 Hz,H-8),6.25(1H,d,J= 9.5 Hz,H-3),5.48(1H,m,H-2′),4.58(2H,d,J= 6.9 Hz,H-1′),1.81(3H,br s,H-4′),1.77(3H,br s,H-5′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:161.3(s,C-2),112.9(d,C-3),143.5(d,C-4),128.7(d,C-5),113.2(d,C-6),162.1(s,C-7),101.5(d,C-8),155.8(s,C-9),112.4(s,C-10),65.4(t,C-1′),118.6(d,C-2′),139.3(s,C-3′),25.8(q,4-OCH3),18.3(q,5-OCH3)。以上数据与文献[21]报道基本一致,故鉴定化合物20为7-preniloxicumarin。

化合物21白色粉末;ESI-MS:m/z193 [M+H]+,分子式为C10H8O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.83(1H,d,J= 9.4 Hz,H-4),7.06(1H,s,H-5),6.96(1H,s,H-8),6.28(1H,d,J= 9.4 Hz,H-3),3.96(3H,s,7-OCH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:161.7(s,C-2),114.6(d,C-3),143.9(d,C-4),111.5(d,C-5),146.6(d,C-6),150.3(s,C-7),99.6(d,C-8),149.4(s,C-9),112.8(s,C-10),56.5(q,7-OCH3)。以上数据与文献[22]报道基本一致,故鉴定化合物21为异东莨菪素。

化合物22白色粉末;ESI-MS:m/z163 [M+H]+,分子式为C9H6O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.70(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),6.35(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.26(1H,dd,J= 7.5,1.2 Hz,H-8),6.98(1H,dd,J= 7.5,1.5 Hz,H-7),6.86(1H,d,J= 1.5 Hz,H-5);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.9(s,C-2),116.97(d,C-3),143.6(d,C-4),112.6(s,C-5),154.3(s,C-6),119.6(s,C-7),117.14(s,C-8),146.6(s,C-9),120.08(s,C-10)。以上数据与文献[23]报道基本一致,故鉴定化合物22为6-羟基香豆素。

化合物23白色粉末,ESI-MS:m/z355 [M+H]+,分子式为C16H18O9;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.57(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.23(1H,s,H-8),6.91(1H,s,H-5),6.16(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),5.46(1H,d,J= 7.6 Hz,H-1′),4.23～3.86(6H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),3.61(3H,s,6-OCH3);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:161.1(s,C-2),113.7(d,C-3),143.7(d,C-4),109.6(s,C-5),146.8(s,C-6),149.7(s,C-7),103.9(d,C-8),150.8(s,C-9),112.8(s,C-10),101.3(d,C-1′),74.2(d,C-2′),77.8(d,C-3′),70.7(d,C-4′),78.5(d,C-5′),61.8(t,C-6′),56.0(q,6-OCH3)。以上数据与文献[24]报道基本一致,故鉴定化合物23为东莨菪苷。

化合物24黄色粉末;ESI-MS:m/z280 [M+H]+,分子式为C17H13NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.49(1H,dd,J= 8.0,1.5 Hz,H-5),7.71(1H,dd,J= 8.7,1.7 Hz,H-8),7.54(1H,d,J= 8.6 Hz,H-13),7.46～7.35(1H,m,H-6),7.27(1H,s,H-3),6.96～6.83(2H,m,H-7,12),6.28(1H,s,H-16),6.07(2H,s,H-17),3.63(3H,s,N-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:154.3(s,C-2),112.7(d,C-3),177.6(s,C-4),123.6(s,C-5),126.7(d,C-6),129.5(d,C-7),126.9(d,C-8),115.9(s,C-9),148.7(s,C-10),132.3(s,C-11),122.7(s,C-12),108.6(d,C-13),141.9(s,C-14),147.9(s,C-15),109.0(d,C-16),101.7(t,C-17),37.2(q,N-CH3)。以上数据与文献[25]报道基本一致,故鉴定化合物24为芸香灵。

化合物25黄色粉末;ESI-MS:m/z280 [M+H]+,分子式为C17H13NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.14(1H,dd,J= 8.3,1.0 Hz,H-5),8.04(1H,d,J= 8.1 Hz,H-8),7.71～7.64(2H,m,H-7,12),7.59(1H,dd,J= 8.1,1.8 Hz,H-16),7.44(1H,ddd,J= 8.1,6.9,1.5 Hz,H-6),7.07(1H,s,H-3),6.92(1H,d,J= 8.1 Hz,H-15),6.01(2H,s,H-17),4.08(3H,s,4-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:162.9(s,C-2),97.6(d,C-3),158.2(s,C-4),121.8(d,C-5),125.3(d,C-6),130.1(d,C-7),129.2(d,C-8),120.4(s,C-9),149.2(s,C-10),134.9(s,C-11),121.7(d,C-12),108.2(d,C-13),148.4(s,C-14),148.9(s,C-15),108.5(d,C-16),101.5(t,C-17),55.7(q,4-OCH3)。以上数据与文献[26]报道基本一致,故鉴定化合物25为芸香宁。

化合物26白色粉末;ESI-MS:m/z225 [M+H]+,分子式为C12H16O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.03(2H,s,H-2,6),6.59(1H,d,J= 15.1 Hz,H-7),6.26(1H,dt,J= 15.2,6.2 Hz,H-8),4.20(1H,dd,J= 16.8,6.0 Hz,H-9β),3.90(6H,s,3,5-OCH3),3.84(3H,s,4-OCH3),3.68(1H,m,H-9α);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:132.7(d,C-1),104.1(d,C-2,6),153.6(s,C-3,5),140.8(s,C-4),130.0(d,C-7),129.2(d,C-8),63.0(t,C-9),56.1(q,3,5-OCH3),60.6(q,4-OCH3)。以上数据与文献[27]报道基本一致,故鉴定化合物26为3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-2-丙烯-1-醇。

化合物27淡黄色粉末;ESI-MS:m/z249 [M+H]+,分子式为C15H20O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.79(1H,d,J= 7.3 Hz,H-5),6.26(1H,dd,J= 7.2,1.2 Hz,H-6),6.55(1H,d,J= 1.6 Hz,H-2),5.95(1H,s,H-1′′),2.62(2H,td,J= 5.2,2.6 Hz,H-1′),2.43(2H,m,H-6′),1.99(3H,s,7′-CH3),1.55～1.63(4H,m,H-2′,5′),1.32～1.38(4H,m,H-3′,4′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:136.6(s,C-1),108.9(d,C-2),147.4(s,C-3),145.5(s,C-4),108.1(d,C-5),121.0(d,C-6),35.4(d,C-1′),31.4(d,C-2′),29.0(d,C-3′,4′),23.9(d,C-5′),43.7(d,C-6′),208.8(s,C-7′),29.7(q,C-8′),100.7(t,C-1′′)。以上数据与相关文献[28]报道基本一致,故鉴定化合物27为moskachan D。

化合物28淡黄色粉末;ESI-MS:m/z193 [M+H]+,分子式为C11H12O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.79(1H,d,J= 7.3 Hz,H-5),6.26(1H,dd,J= 7.2,1.2 Hz,H-6),6.55(1H,d,J= 1.6 Hz,H-2),5.95(1H,s,H-1′′),2.78(2H,t,J= 5.2 Hz,H-1′),2.53(2H,m,H-2′),2.03(3H,s,3′-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:135.6(s,C-1),108.9(d,C-2),147.4(s,C-3),145.5(s,C-4),108.1(d,C-5),121.0(d,C-6),46.2(d,C-1′),30.7(d,C-2′),210.8(s,C-3′),30.2(q,C-4′),100.7(t,C-1′′)。以上数据与文献[29]报道基本一致,故鉴定化合物28为胡椒基丙酮。

化合物29黄色粉末;ESI-MS:m/z611 [M+H]+,分子式为C27H30O16;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.60(1H,d,J= 1.9 Hz,H-2′),7.55(1H,dd,J= 8.6,1.9 Hz,H-6′),7.18(1H,d,J= 8.6 Hz,H-5′),6.40(1H,d,J= 1.9 Hz,H-8),6.19(1H,d,J= 1.9 Hz,H-6),5.11(1H,d,J= 7.6 Hz,H-1′′),4.37(1H,br s,H-1′′′),0.99(3H,d,J= 6.1 Hz,5′′′-CH3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:156.8(s,C-2),133.8(s,C-3),177.8(s,C-4),161.6(s,C-5),99.2(d,C-6),164.5(s,C-7),94.1(d,C-8),157.1(s,C-9),104.5(s,C-10),121.7(s,C-1′),115.7(d,C-2′),145.3(s,C-3′),148.9(s,C-4′),116.7(d,C-5′),122.1(d,C-6′),101.6(d,C-1′′),74.5(d,C-2′′),76.8(d,C-3′′),71.0(d,C-4′′),76.4(d,C-5′′),67.4(t,C-6′′),101.3(d,C-1′′′),70.9(d,C-2′′′),70.5(d,C-3′′′),72.3(d,C-4′′′),68.8(d,C-5′′′),18.2(q,C-6′′′)。以上数据与相关文献[30]报道基本一致,故鉴定化合物29为芦丁。

化合物30淡黄色稠状固体;ESI-MS:m/z755 [M+H]+,分子式为C34H42O19;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.71(1H,d,J= 16.0 Hz,H-3′′′),7.66(1H,d,J= 16.0 Hz,H-3′′),6.92(2H,s,H-5′′′,9′′′),6.91(2H,s,H-5′′,9′′),6.54(1H,d,J= 16.0 Hz,H-2′′′),6.44(1H,d,J= 16.0 Hz,H-2′′),5.75(1H,d,J= 8.8 Hz,H-1),5.22(1H,dd,J= 9.2,8.8 Hz,H-3),4.36(1H,d,J= 8.0 Hz,H-1′),4.21(1H,br d,J= 10.4 Hz,Ha-6),3.88(12H,s,6′′,6′′′,8′′,8′′′-OCH3),3.86(1H,dd,J= 4.0,10.4 Hz,Hb-6),3.85(1H,d,J= 12.0 Hz,Ha-6′),3.80(1H,dd,J= 9.0,8.7Hz,H-4),3.78(1H,m,H-5),3.74(1H,dd,J= 9.1,8.8 Hz,H-2),3.64(1H,dd,J= 12.0,4.0 Hz,Hb-6′),3.35(1H,t,J= 9.2 Hz,H-3′),3.26(2H,m,H-4′,H-5′),3.23(1H,dd,J= 9.2,8.0 Hz,H-2′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:95.7(d,C-1),72.4(d,C-2),78.6(d,C-3),69.2(d,C-4),77.6(d,C-5),69.3(t,C-6),104.6(d,C-1′),75.1(d,C-2′),78.0(d,C-3′,C-5′),71.6(d,C-4′),62.7(t,C-6′),167.0(s,C-1′′),115.0(d,C-2′′),147.0(d,C-3′′),126.1(s,C-4′′),106.9(d,C-5′′,9′′),149.2(s,C-6′′,6′′′,8′′,8′′′),139.4(s,C-7′′),168.3(s,C-1′′′),116.3(d,C-2′′′),148.5(d,C-3′′′),126.5(s,C-4′′′),107.2(d,C-5′′′,9′′′),139.8(s,C-7′′′),57.0(q,C-6′′,6′′′,8′′,8′′′-OCH3)。以上数据与文献[31]报道基本一致,故鉴定化合物30为1,3-disinapoylgentiobiose。

化合物1～30结构见图1。

图1 化合物1～30的结构Fig.1 Structures of compounds 1-30

2.2 抗EBV活性筛选结果

将30个化合物均进行体外抗EBV活性评价,结果显示在30 μmol/L的浓度下,共有6个化合物抑制EB病毒裂解复制达到50%以上。随后继续测试这6个化合物的IC50,CC50以及SI(见表1),测试结果表明化合物5、24与阳性对照组右旋芸香苦素对比,显示更高抗EB病毒活性及选择性。

表1 臭草中化合物的抑制EBV裂解复制活性及细胞毒性

3 讨论与结论

臭草为药用的多年生草本植物,具有特殊的香味,原产于地中海沿岸,在我国南北均有种植,多以盆栽。本实验采用现代色谱技术对臭草95%提取物的二氯甲烷部位进行了化学成分研究,从中分离得到30个化合物,化合物1～13为吖啶酮类生物碱类化合物,化合物24、25为喹啉酮类生物碱类化合物,化合物14～23为香豆素类化合物,其他化合物为芳香醇、酮、黄酮苷以及二聚苯丙素糖苷等化合物,其中化合物2、7、9、12、20、22、23、26、27、28、30为首次从该植物中分离得到。对所得的化合物进行抑制EBV裂解复制活性及细胞毒性活性筛选,从结果来看,所得化合物中5、14、20、24、25、27等6个化合物对抑制EBV裂解复制活性较明显,其中化合物5和24抑制EBV活性高于阳性对照右旋芸香苦素抑制活性。目前对于臭草的抗病毒活性成分的报道较少,主要集中在流感病毒、疱疹病毒[3],为进一步研究抗病毒的物质基础,我们还将继续研究其化学成分,并重点关注生物碱,以期获得具有较好抑制EBV裂解复制活性的化合物。本研究内容丰富了臭草的化学成分信息,为臭草进一步药用价值开发提供了物质基础和科学依据,化合物5、24两类具有抑制EBV活性的化合物为鼻咽癌药物的开发提供了活性骨架。