2种三苯胺衍生物的合成与生物成像研究

程振原，孙 婉,孟繁辉，张晓钰，李杰婷，曹梦璇，郑董仪

（德州学院医药与护理学院，山东 德州 253023）

有机发光材料因具有良好的光学稳定性，被广泛应用于光电器件、化学/生物传感和生物应用等领域。改善有机发光材料的发光性能和效率，一直是该领域的研究热点[1-4]。传统的有机发光材料在稀溶液中的发光性能良好，但聚集时则会发生聚集诱导荧光淬灭现象（Aggregation-caused quenching,ACQ）[5-8]。尽管科学家们做了很多尝试，比如采用化学改性和物理方法来阻止聚集诱导荧光淬灭现象，但聚集是自发过程，聚集诱导荧光淬灭现象很难突破。因此，聚集诱导荧光淬灭这一传统有机发光材料普通存在的现象，极大限制了其广泛应用。唐本忠于2001年提出了聚集诱导荧光技术(Aggregation-induced emission，AIE)，并通过进一步的实验和理论模拟，提出了限制分子内运动（Restriction of intermolecular motion, RIM）理论。该类材料因分子运动受限，会减少聚集时的π-π相互作用，从而使得分子即使处在聚集状态，依然具备荧光性能[9-13]。目前，各种聚集诱导荧光材料已应用于荧光显像、生物探针等领域。

在众多AIE分子中，三苯胺具有特殊的螺旋桨结构，可以更好地阻止分子间的π-π堆积，并构建多种AIE化合物[14-17]。另外，作为给电子基，三苯胺与吸电子基通过单键或共轭键相连后，可以更好地调节分子内的电子离域态，从而实现对化合物光学性能的调控[18-19]。目前已有大量的三苯胺衍生物作为AIE分子，应用于光学材料领域。

本文以三苯胺为中心，通过缩合反应合成了2种D-π-A型的三苯胺衍生物TP-NO和TP-NH，使用核磁和质谱进行了表征，通过荧光发射光谱和紫外-可见吸收光谱，研究了二者在不同溶液中的光学性质及AIE特性。研究了构效关系对光学性质的影响，采用扫描电子显微镜，对其在不同溶剂中的SEM图像进行了研究，并研究了TP-NH在细胞和活体中的荧光成像。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：2-甲基-6-硝基噻唑、2-甲基-6-氨基噻唑、4-(二苯氨基)苯甲醛、哌啶、二氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇（EtOH）、乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）、水。

仪器：Bruker 400 Ultra-shield 核磁共振仪，Perkin-Elmer240 元素分析仪，Finnigan LCQ质谱仪，UV-3600 紫外可见分光光谱仪，FL-7000 荧光分光光度计，Ultra Plus 扫描电镜。

1.2 化合物的合成

TP-NO与TP-NH的合成路线见图1。

图1 TP-NO与TP-NH的合成路线

1.2.1 TP-NO合成

将0.97g（5mmol）的2-甲基-6-硝基苯并噻唑、 2.73g（10mmol）的4-(二苯基氨基)苯甲醛和250mL哌啶溶于100mL乙醇中，混合物搅拌后回流反应24h。旋转蒸发除去溶剂，产物用柱层析进行分离提纯（洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯=3∶1），得到红色粉末0.45g，收率20%。1H NMR (400MHz，DMSO-d6)，δ×10-6：9.14~9.13 (d，J=9.14Hz，1H)，8.33~8.30(dd，J=8.32Hz，1H)，8.09~8.07 (d，J=8.08Hz，1H)，7.77~7.68 (m，3H)，7.54~7.50(d，J=7.52Hz，1H)，7.39~7.35(m，4H)，7.17~7.10(m，6H)，6.93~6.91(d，J=6.92Hz，2H)。13C NMR(100MHz，DMSO-d6)，δ：173.72，158.28，149.65，146.84，144.69，140.11，130.66，130.07，128.37，125.79，124.86，122.86，122.42，121.39，119.68，119.25。HRMS-ESI：m/z calcd.for C27H20N3O2S+，[M+H]+：450.1198， found 450.1268。

1.2.2 TP-NH的合成

按照相同的步骤，将2-甲基-6-硝基苯并噻唑替换为2-甲基-6-氨基噻唑，得到化合物TPNH 0.42g，收率20%。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ×10-6：7.62~7.55(m，3H)，7.36~7.32(t，J=7.8Hz，4H)，7.31(s，2H)，7.12~7.03(m，7H)，6.93~6.91(d，J=8.7Hz，2H)，6.76~6.74(dd，J=8.7Hz，2.2Hz，1H)，5.51(s，2H)。13C NMR(100MHz，DMSO-d6)，δ：160.95，148.46，147.98，147.18，145.68，136.28，134.80，130.21，128.99，125.26，124.32，123.32，122.44，120.93，115.43，104.27。HRMS-ESI：m/z calcd.for C27H22N3S+，[M+H]+：420.1456，found 420.1526。

2 结果与讨论

2.1 光学性质

为了比较2个化合物的结构对光学性质的影响，分别配制了浓度为1×10-3M的母液，使用紫外可见光光度计和荧光光度计，分别测试了化合物TP-NO和TP-NH在不同溶剂中的吸收光谱和发射光谱。用得到的光谱数据分析2个化合物在不同溶剂中的光学性质，以及结构变化对光学性质的影响。

2.1.1 紫外-可见吸收光谱

化合物TP-NH、TP-NO的吸收光谱见图2。在水溶剂中，化合物TP-NO仅有1组吸收峰，位于450nm处；化合物TP-NH有2个最大的吸收峰，分别位于300nm和450nm处。其中短波的吸收峰是由三苯胺的π→π*电子跃迁造成的，长波的吸收峰是整个共轭结构中因发生了分子内电荷转移而造成的[20]。

图2 TP-NO、TP-NH在水中的吸收光谱

TP-NO在不同溶剂中的紫外吸收光谱见图3。由图3可知，当溶剂极性发生改变时，TP-NO的紫外吸收强度的变化不大，在四氢呋喃中发生了150nm的蓝移，在其他溶剂中则没有发生明显的红移或者蓝移现象。结果表明，溶剂的极性对TP-NO的紫外吸收作用无较明显的影响。

图3 TP-NO在不同溶剂中的吸收光谱(浓度1×10-3M，以下同)

TP-NH在不同溶剂中的紫外吸收光谱见图4。在其他溶剂中，TP-NH在400nm左右有一处最大吸收峰，峰的位置没有改变，表明极性的改变与基态的电子结构无关。该峰位为局域激发状态，主要由三苯胺的π→π*的跃迁导致。结果显示，溶剂的极性对TP-NH吸收的影响较小，且无明显的红移或者蓝移的现象，在水中只发生了微弱红移，说明溶剂的极性对TP-NH吸收的影响不大[21]。

图4 TP-NH在不同溶剂中的吸收光谱

2.1.2 荧光发射光谱

图5是TP-NO和TP-NH在二氯甲烷中的荧光光谱。由图5可知，在二氯甲烷中，TP-NH的荧光峰处于498nm处，TP-NO的荧光峰处于517nm处。硝基为典型的吸电子基，氨基为典型的供电子基，硝基的引入增强了D-π-A型化合物吸电子基的吸电子能力，使得荧光峰发生了红移。

图5 TP-NO和TP-NH在二氯甲烷中的荧光光谱

图6是TP-NO在不同溶剂中的荧光发射光谱。由图6可知，化合物TP-NO在四氢呋喃、乙酸乙酯和N,N-二甲基甲酰胺中均表现出较强的荧光，而在二氯甲烷、无水乙醇、二甲基亚砜和水中，荧光的发射强度较低。

图6 TP-NO在不同溶剂中的荧光发射光谱

图7是TP-NH在不同溶剂中的荧光发射光谱。由图7可知，TP-NH在不同的溶剂中表现出不同的荧光强度和位置。在四氢呋喃溶剂中，TP-NH的荧光发射强度最强，波长位于500nm处，而在无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和水中几乎没有荧光强度，表明在极性大的溶剂中，TP-NH的荧光强度降低，激发态能量被大量消耗，从而导致了荧光淬灭。

图7 TP-NH在不同溶剂中的荧光发射光谱

2.2 聚集诱导荧光性质

2种化合物都可以溶解于四氢呋喃，都不溶解于水。为了研究TP-NO和TP-NH的聚合诱导荧光性能，我们对不同含水量的四氢呋喃/水混合液（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）进行了荧光分析。

2种化合物在不同比例的四氢呋喃/水混合液中的荧光发射光谱见图8。化合物TP-NO在纯四氢呋喃溶液中发射出微弱的荧光，随着含水量增加，TP-NO的荧光发射强度逐渐增强，含水量达到60%时，TP-NO的荧光发射强度达到最大值。聚集体中荧光发射增强的原因是分子内旋转受阻，非辐射性的能量因消耗而减弱或消失。此外，化合物TP-NO分子结构内硝基的扭曲构像可以延长分子间的距离，并因π→π键的堆积而减少了荧光淬灭[22]。含水量大于60%后，TP-NO的荧光发射强度逐渐降低，可能是随着含水量增加，TP-NO在混合溶液中的溶解度出现降低而导致的。化合物TP-NH在纯四氢呋喃溶液中的荧光强度最大，随着含水量增加，TP-NH的荧光逐渐降低且荧光发射峰值发生了红移，表现出聚集诱导荧光淬灭现象。

图8 TP-NO和TP-NH在不同含水量的四氢呋喃/水混合液中的荧光性能

2.3 扫描电镜结果

为了更好地研究2种化合物在不同极性溶剂中的自组装状态，我们测试了二者在二氯甲烷和乙醇中的自组装形貌图。

化合物TP-NH在二氯甲烷和无水乙醇溶液中的扫描电镜图见图9。可以看出，在二氯甲烷中TP-NH呈现圆球状，在无水乙醇中则是棒状的形态。化合物TP-NO在二氯甲烷和无水乙醇溶液的扫描电镜图见图10。可以看出化合物TP-NO 在二氯甲烷中呈现出规则的花型结构，而在无水乙醇中则是分散的、不规则的纳米颗粒。这可能是化合物在不同溶剂中的溶解性差异以及相互作用产生的差异导致的。取代基的不同，使得2种化合物在二氯甲烷和无水乙醇溶液中呈现出2种不同的组装形态。

图9 TP-NH在二氯甲烷、无水乙醇中的SEM图像

图10 TP-NO在二氯甲烷、无水乙醇中的SEM图像

2.4 荧光显像

对2个化合物的荧光性质进行研究，发现TP-NH具有较好的荧光性质，为此将其应用于生物成像领域。对TP-NH在肿瘤细胞中的细胞毒性进行了研究，结果表明，在50μM浓度范围内，肿瘤细胞的死亡率在60%以上，证明TP-NH具有较好的生物安全性（图11）。将10μM的TP-NH与细胞和斑马鱼共孵育30min后，利用荧光显微镜观察成像效果（图12），在细胞和斑马鱼体内均观察到绿色荧光，表明TP-NH成功进入了细胞和斑马鱼，并成功对其染色。

图11 不同浓度的TP-NH对Hela细胞的毒性效应

图12 TP-NH对Hela活细胞和斑马鱼的细胞显影图

3 结论

本文通过缩合反应，合成了2种三苯胺衍生物TP-NH、TP-NO。实验结果表明，三苯胺衍生物TP-NH的荧光强度比TP-NO更强，TP-NO的发射波长相对于TP-NH发生了红移。TP-NH表现出ACQ现象，TP-NO则表现出AIE现象。采用扫描电镜，研究了三苯胺衍生物在小极性溶剂二氯甲烷和大极性溶剂乙醇中的自组装形貌，结果表明，TP-NH在二氯甲烷中自组装成了球形纳米颗粒，在乙醇中自组装成了棒状。TP-NO在二氯甲烷中自组装成了花型，在乙醇中自组装成了无规的形状。2种三苯胺衍生物均表现出较好的荧光性能。TP-NH表现出较好的荧光现象，可对细胞和活体进行染色，因此在细胞和活体成像领域具有潜在的应用价值。这些结果可为后续的实验和实际应用提供参考。