隔药饼灸对免疫抑制兔调节性B细胞介导的TIGIT/CD155和JAK2/STAT3信号通路的影响

毛凯荣 ，熊罗节 ，田岳凤 ，徐小珊 ，翟春涛 ，李玮

1.广州中医药大学深圳医院，广东 深圳 518034； 2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.山西中医药大学，山西 晋中 030619

机体免疫系统能够通过识别“自己”与“非己”，从而祛除对人体产生危害的抗原，并对人体自身产生的不利于发挥正常生理功能的细胞或损伤进行清除或修复。“正气存内，邪不可干”（《素问·刺法论篇》），正气的作用就是抵御病邪。“阴阳俱虚，火自当之”（《灵枢·官能》），艾灸有补虚培元作用，能治疗由于正气虚而引起的慢性病症。现代研究从不同角度证实艾灸与免疫有密切关系[1-2]。

课题组前期研究表明，隔药饼灸能通过调控免疫细胞和相关分子，一定程度上改善和恢复免疫抑制状态的机体免疫功能[3]。在此基础上，本研究从隔药饼灸通过调节性B细胞（Breg）介导的TIGIT/CD155和JAK2/STAT3信号通路出发，探究其影响免疫功能的机制及不同指标间的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物

普通级日本大耳白兔32只，雌雄各半，体质量（2.3±0.3）kg，北京西山昌扬养殖中心提供，动物许可证号SCXK（京）2016-0007。饲养于温度20～24 ℃、相对湿度40%～60%环境。本实验严格遵守《关于善待实验动物的指导意见》相关规定，并通过山西中医药大学动物伦理委员会批准（2016DW019）。

1.2 药物及制备

熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮，由山西中医药大学附属医院中药房提供。艾绒购于北京同仁堂中药饮片有限责任公司，批号1808026。用模具将艾绒制成半径0.3 cm、高0.5 cm、质量为（0.3±0.03）g圆锥形艾炷。用卷烟器将质量为（1.5±0.25）g的艾绒制成艾条。

将熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮按8∶4∶4∶3∶3∶3比例混合后过120目筛磨成粉，将药粉、赋形剂（小麦粉）和水按1∶1∶1.2比例混合均匀，使用模具制成半径0.4 cm、高0.4 cm、质量为（0.9±0.05）g药饼。

1.3 主要试剂与仪器

环磷酰胺（批号22011925），江苏盛迪医药有限公司；白细胞介素（IL）-10、CD155、TIGIT ELISA试剂盒（批号均为20210703A），上海酶联生物科技有限公司；JAK2抗体（批号FL-6001）、STAT3抗体（批号714094），北京博奥森生物技术有限公司；TIGIT抗体（批号PAB180017），艾博抗（上海）贸易有限公司；增强型RIPA裂解液（批号AR0102），武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号AR0146），武汉博士德生物工程有限公司；75%医用乙醇（批号20191002），山东安捷高科消毒科技有限公司。

电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYCZ-24DN），电转仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYCZ-40B），酶标仪（兰雷勃集团，型号MK3），水浴锅（德国徕卡，型号HI1210），成像系统（上海天能科技有限公司，型号Tanon-5200），正置显微镜（日本奥林巴斯有限公司，型号CX41），石蜡切片机（湖北徕克医疗仪器有限公司，型号SQ2125），数码相机（日本尼康，型号D510）。

1.4 分组及造模

动物按体质量采用随机数字表法随机分为空白组、模型组、艾条灸组和隔药饼灸组，每组8只。适应性喂养1周后开始造模，将环磷酰胺用生理盐水配制成浓度为20 mg/mL溶液，模型组、艾条灸组和隔药饼灸组按60 mg/kg腹腔注射，连续7 d[4]，空白组每日腹腔注射等体积生理盐水。以进食量减少、毛色光泽度降低、掉毛量增加和精神状态萎靡为造模成功标准。

1.5 干预

参照《实验针灸学》[5]动物腧穴定位法及拟人比照法，选取“神阙”“关元”“足三里”“脾俞”“肾俞”。艾条灸组先将兔俯卧位固定于兔台，使用艾灸架将自制艾条置于双侧“脾俞”“肾俞”“足三里”上3 cm处，用线香点燃，待俯卧位施灸结束后，再以仰卧位固定兔，同法于“神阙”“关元”施灸，每穴每次灸1壮，隔日灸，共10次。隔药饼灸组先将兔俯卧位固定于兔台，将制备的药饼放于双侧“脾俞”“肾俞”“足三里”，上置艾炷，用线香点燃艾炷施灸，待俯卧位施灸结束后，再以仰卧位固定兔，同法于“神阙”“关元”施灸，每穴每次灸5壮，隔日灸，共10次。空白组和模型组只固定，不进行干预。

1.6 取材

干预结束后次日，20%乌拉坦耳缘静脉注射5 mL/kg麻醉兔，用采血管采集腹腔静脉血，血液静置30 min，3000 r/min离心10 min，血清置于EP管中，-20 ℃保存，用于ELISA检测。采血后迅速摘取肝脏和脾脏，切取脾脏上端组织（1.5 cm×1 cm×0.2 cm）、肝右叶中段组织（2 cm×1 cm×1 cm），置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫组化检测；再切取肝右叶中段组织（2 cm×1 cm×1 cm），置于冻存管中，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot检测。

1.7 指标检测

1.7.1 ELISA检测

根据ELISA试剂盒说明书进行样本稀释、抗体孵育、底物显色操作，酶标仪波长450 nm检测样品吸光度（OD值），计算血清IL-10、TIGIT、CD155含量。

1.7.2 Western blot检测

提取肝组织总蛋白，进行蛋白定量。制胶，上样（10 μg），电泳（80 V、60 min，120 V、60 min），转膜（220 mA、100 min），5%BSA 4 ℃封闭2 h，加入JAK2、STAT3一抗（1∶2000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶3000），室温孵育1 h，显影，成像。利用Image J软件进行灰度分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.7.3 免疫组化检测

取多聚甲醛固定的肝、脾组织，脱水、透明、浸蜡后包埋，制成蜡块并切片，脱蜡，水化，抗原修复，封闭，滴加TIGIT一抗（1∶2000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶1000）孵育，脱水透明并封片。每张切片随机取4个200倍视野拍照，采用Image Pro Plus 6.0软件进行分析，计算阳性表达的平均光密度。

1.8 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料满足正态分布用±s表示，多组间比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验。采用Pearson相关性分析对IL-10、TIGIT、CD155、JAK2、STAT3两两之间相关性进行评价，首先在SPSS中以散点图判断两指标间是否存在线性回归趋势，如符合线性趋势再进一步以最小二乘法建立拟合模型，并以相关系数（r）评价相关性。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隔药饼灸对模型兔血清白细胞介素-10、TIGIT、CD155含量的影响

与空白组比较，模型组兔血清IL-10含量显著减少，TIGIT、CD155含量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，艾条灸组和隔药饼灸组兔血清IL-10含量显著增加，TIGIT、CD155含量显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组兔血清IL-10、TIGIT、CD155含量比较（±s，pg/mL）

表1 各组兔血清IL-10、TIGIT、CD155含量比较（±s，pg/mL）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别空白组模型组艾条灸组隔药饼灸组CD155194.15±6.97251.01±9.69**222.75±5.27##217.56±4.88##只数8888 IL-10489.02±62.21220.93±65.45**331.42±67.18##432.88±29.11##TIGIT 382.51± 4.48519.10±11.63**445.67± 8.57##445.70±10.95##

2.2 隔药饼灸对模型兔肝组织JAK2、STAT3蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组兔肝组织JAK2、STAT3蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，艾条灸组JAK2、STAT3蛋白表达有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），隔药饼灸组肝组织JAK2、STAT3蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组兔肝组织JAK2、STAT3蛋白表达比较（±s，每组8只）

2.3 隔药饼灸对模型兔肝组织和脾组织TIGIT表达的影响

肝组织TIGIT阳性表达主要在细胞膜及细胞质内，脾组织TIGIT阳性表达主要位于白髓动脉周围淋巴鞘，多呈棕黄色。

与空白组比较，模型组兔肝组织和脾组织TIGIT表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，艾条灸组和隔药饼灸组兔肝组织、脾组织TIGIT表达降低。见图2、图3、表2。

图2 各组兔肝组织TIGIT阳性表达（免疫组化染色，×200）

图3 各组兔脾组织TIGIT阳性表达（免疫组化染色，×200）

表2 各组兔肝组织和脾组织TIGIT表达比较（±s，平均光密度）

表2 各组兔肝组织和脾组织TIGIT表达比较（±s，平均光密度）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

脾组织0.128921±0.017038 0.207435±0.020901**0.148481±0.031946##0.154947±0.014626##组别空白组模型组艾条灸组隔药饼灸组只数8888肝组织0.078307±0.007597 0.129103±0.014293**0.090070±0.017162##0.092790±0.012536##

2.4 血清白细胞介素-10、TIGIT、CD1555与肝组织JAK2、STAT3相关性分析

Pearson相关性分析结果显示，血清IL-10与CD155（r=-0.68，P＜0.01）、TIGIT（r=-0.72，P＜0.01）含量呈负相关，与肝组织JAK2（r=0.73，P＜0.01）、STAT3（r=0.75，P＜0.01）表达呈正相关；血清CD155与TIGIT（r=0.61，P＜0.05）含量呈正相关，与肝组织JAK2（r=-0.84，P＜0.01）、STAT3（r=-0.86，P＜0.01）表达呈负相关；血清TIGIT与肝组织JAK2（r=-0.88，P＜0.01）、STAT3（r=-0.89，P＜0.01）表达呈负相关；肝组织JAK2与STAT3（r=0.98，P＜0.01）表达呈显著正相关。见图4。

图4 血清IL-10、TIGIT、CD155与肝组织JAK2、STAT3 Pearson相关性分析（r）

3 讨论

免疫抑制是指在机体在疾病或应激状态下出现细胞因子表达或分泌异常的一种状态。免疫抑制性因子活性增强，免疫活性细胞数目减少或亚群改变，免疫器官发生功能性和器质性改变，使机体防御能力下降。课题组前期研究表明，隔药饼灸能通过六味地黄方、腧穴和艾灸的综合作用，一定程度上改善免疫抑制引起的免疫器官、免疫细胞和免疫因子损伤[3]。

Breg是一类通过分泌多种细胞因子、调控T细胞及直接作用于恶性肿瘤细胞等多途径发挥免疫抑制性作用的B细胞[6]。其发挥免疫抑制功能主要通过IL-10介导相关信号通路，影响下游效应基因发挥功能[7]，相关信号通路包括JAK2/STAT3信号通路和TIGIT/CD155信号通路等[8-9]。在对系统性红斑狼疮小鼠脾细胞的干预中发现，JAK2/STAT3信号通路活化能促进Breg分化和IL-10水平变化[10]。而对B细胞特异性缺失T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-1基因的小鼠研究表明，高表达TIGIT和IL-10的Breg具有强免疫抑制作用[11]。并且有研究表明，TIGIT可能参与Breg相关反应[12]。因此，本研究围绕与Breg相关的IL-10/JAK2/STAT3通路及TIGIT/CD155通路，观察隔药饼灸对免疫抑制的调节机制。结果表明，IL-10含量变化与JAK2/STAT3和TIGIT/CD155信号通路蛋白水平变化存在相关性，推测在免疫抑制模型中，存在Breg通过分泌IL-10介导JAK2/STAT3信号通路的调控机制，同时也可能影响TIGIT/CD155信号通路的变化，而隔药饼灸能通过调节以上通路改善免疫抑制状态。

JAK2/STAT3信号通路在肿瘤等免疫异常性疾病中发挥负向调控作用[13]，其水平变化与IL-10水平变化存在相关性，且IL-10水平变化会引起JAK2/STAT3信号通路下游分子变化，从而介导细胞增殖、凋亡及分化[14-15]。本研究相关性分析结果也表明，JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平与血清IL-10含量存在相关性，与上述研究结果一致。证明在免疫抑制状态下，也存在IL-10水平变化引起的JAK2/STAT3信号通路蛋白表达的改变，且不同灸法干预呈现出差异性的调节结果，隔药饼灸的干预效果优于艾条灸。

TIGIT是继PD-1之后在肿瘤研究中的又一免疫检查点受体，CD155是其下游蛋白，TIGIT/CD155信号通路能负向调控免疫反应[16]。免疫损伤模型研究表明，IL-10与TIGIT/CD155信号通路共同参与免疫负向调控作用[17]。免疫组化结果显示，隔药饼灸可以降低模型兔脾组织和肝组织TIGIT水平，改善机体免疫力。且在免疫抑制模型中IL-10水平变化与TIGIT/CD155信号通路蛋白表达水平的变化表现出一定的负相关性，推测受Breg介导的IL-10调控途径与TIGIT调控途径之间或许有共同调控模式。

脾为中枢免疫器官之一，含有大量淋巴细胞和巨噬细胞，是机体免疫细胞定居和免疫应答发生的场所。本课题组前期关于脾脏形态学的研究表明，隔药饼灸能改善模型兔脾脏损伤[18]。同时，在黑虎掌菌子实体多糖干预环磷酰胺致小鼠免疫抑制实验中，脾脏p-JAK2、p-STAT3蛋白水平与脾脏指数成反比，表明JAK2/STAT3信号通路与脾脏免疫功能的分子机制相关[19]。结合本研究关于脾脏TIGIT免疫组化结果显示，脾脏TIGIT水平变化受模型兔脾脏免疫功能的影响，并且受影响程度与肝组织TIGIT变化水平一致，提示脾脏与肝脏所受调控机制可能一致。

以往对于JAK2/STAT3与TIGIT/CD155之间关系研究的报道较少，有关膀胱癌高通量分析的报告显示，TIGIT与JAK2/STAT3存在高度相关性[20]。本研究通过对相关蛋白不同水平的检测发现，两者之间可能存在一定联系，相关性分析结果也表明，TIGIT/CD155与JAK2/STAT3之间存在显著负相关性，提示隔药饼灸对共抑制分子TIGIT的调控可能有JAK2/STAT3通路的参与。

综上，本研究在前期研究基础上发现，隔药饼灸改善免疫抑制兔免疫功能是在Breg作用的基础上，通过IL-10介导的JAK2/STAT3通路完成的，该调控轴可能与TIGIT的参与有一定关系。但是本研究对于艾灸干预Breg的机制研究尚有不足，对TIGIT是否通过JAK2/STAT3通路调控细胞凋亡等途径未作更深入的研究，这也是课题组今后的研究方向。