生物降解材料聚苹果酸的工艺研究进展

王召霞，黄煜琪，赵 蓉，杜雨泽，马晓军，李冬娜,

（1.天津科技大学轻工科学与工程学院，天津 300457；2.浙江大胜达包装股份有限公司，杭州 311215；3.山西工程技术学院，阳泉 045000）

传统石油基高分子聚合物具有耐久性、耐腐蚀性和优良的性能，是目前主要的包装材料来源。然而，由于石油基塑料难以在短时间内自然降解，多年来对全球生态环境造成了大范围的污染。同时，塑料制品的工业化生产也导致了全球能源消耗的速度迅速攀升，石油资源供不应求，经济发展受到严重阻碍。加之近年来限塑令与双碳计划的颁布实施，一方面，人类必须开发新的清洁能源作为维持全球经济运转的储备资源；另一方面，迫切需要研发可降解的塑料以替代不可回收的传统塑料。生物质作为一种清洁低碳、原料丰富且高效的可再生能源，具有显著的节能减排效益。我国生物质种类众多，储量巨大，其中80%以上来自农林废弃物、林业废弃物等木质纤维素材料[1]。全球每年林业和农业废弃物年产量达1500 亿t～2000 亿t[2-3]，因此，合理开发利用这些木质资源已成为全球经济可持续发展的重大战略决策和选择。

聚苹果酸（PMA）是一种生物高分子材料，是以唯一的单体L-苹果酸（L-malic acid，L-MA）通过无数酯键聚合后形成的脂肪族聚合物，具有优异的生物相容性、可生物降解性、易修饰性及水溶性，在生物医学材料、可降解塑料、食品包装材料等方面被广泛研究，是最具发展潜力的“绿色塑料”[4]。近年来，PMA 的生物发酵技术成为国内外学者日渐关注的方向。通过葡萄糖、木糖等为碳源底物被微生物代谢以合成PMA，避免了有毒溶剂的使用，反应过程简单温和，能耗低，且产物分子量大。然而，PMA 生物发酵时的碳源成本占总生产成本的60%[5]，限制了PMA 的工业化生产。由于木质生物质含丰富的纤维素和半纤维素，能产生大量葡萄糖和木糖，是理想的替代碳源。利用以廉价生物质能源制备增值化学品的现代生物技术，实现了废弃木质资源转化和高值化利用，同时在一定程度缓解全球能源枯竭和生态环境污染的危机。

1 聚苹果酸的结构及性质

PMA 是一种以L-苹果酸单体通过38 个酯键相互连接而成的一种水溶性脂肪族聚酯化合物，结构简式为HOOCCH2CH(OH)COOH。在PMA 的分子链中，一苹果酸分子的α-羟基与另一分子的β-羧基是通过酯化作用连接起来的，因此PMA 中存在大量的酯键、羟基和自由羧基。PMA 具有3 种结构形态，分别是α-PMA、β-PMA、γ-PMA，如图1 所示，其中β 型PMA 是唯一可以在自然界生物体内合成的构型[6]。

图1 PMA 的三种结构

生物合成的PMA 经分离和纯化后，一般以钙盐、钠盐等盐的形式或自由酸的形态存在，经过冷冻干燥或喷雾干燥后在常态下呈白色粉末状固体[7]。PMA 分子量的变化范围很大，故没有固定熔点和玻璃化温度。商用PMA 溶液呈橘红色透明状，密度1.19～1.22 g/cm3，pH 值为1～2。具有高度化学稳定性及热稳定性，分解温度为330 ℃，不随水蒸气挥发。

PMA 是一种阴离子酸，其分子链上存在无数酯键，在无机酸、酶解及加热条件（185 ℃）的作用下会发生水解而断裂分解成L-MA[8]。L-MA 是生物体内三羧酸（TCA）循环的中间代谢物，能被用作生物体生长代谢的能量[9-10]，其半数致死量LD50达3.3 g/kg，故L-MA 和PMA 几乎没有毒性，同时PMA 具有优异的生物相容性、生物可降解性和无免疫原性等特性[11]。PMA 分子链中有许多游离的羧基，应用这些具有反应活性的羧基基团，可与其他功能性分子反应，最终形成具有多种功能的纳米平台[12-13]。羧基与某些药物基团的有毒侧链结合后，可降低其毒副作用[14]。由于亲水性羧基，PMA 具有良好的水溶性和吸水性。

2 聚苹果酸的合成方法

2.1 化学合成法

化学合成法分为直接聚合和开环聚合，能够获得三种构型的PMA。直接聚合法以熔融的L-MA 为原料，在无溶剂或有溶剂（二苯醚）的情况下加入催化剂（氯化亚锡、锡粉或氧化亚锡），于高温下发生脱水酯化反应，一步形成γ-PMA。此法步骤简单，但温度要求高，故非常耗能，且催化剂含毒，产物复杂，分离提纯的难度高，而且制备的PMA 分子量较低（一般为1500～5000 Da），优点是简单方便，使用有机溶剂少，产率高，能满足应用范围小的低分子量PMA生产，是相对“绿色”的合成方法。开环聚合法分两种：内酯开环聚合和交酯开环聚合。交酯开环聚合是以天冬氨酸为初始原料，加入苄醇和硫酸，在NaNO3的作用下取代氨基留下羧基以形成交酯，再通过氢解开环聚合形成α-PMA。内酯开环聚合是以L-MA 为原料，经一系列反应形成四元环状单体苄酯苹果酸内酯，阴离子开环聚合得到中间体聚β-苹果酸苄酯，再用引发剂氢解而开环脱苄得到链状β-PMA[15-16]。此法的优点是反应温度低，PMA 相对分子量大，能达几万至几十万；但是，此法成本高，产率低，反应步骤复杂，产物分离提纯难。

2.2 生物合成法

生物合成法是指利用微生物吸收碳源和营养物质进行代谢和生长，以分泌代谢产物PMA。葡萄糖、木糖、蔗糖、半乳糖、果糖均可被微生物利用以转化PMA，再经下游处理后可得到PMA 纯品。生物合成法的原料来源广、资源丰富，反应过程温和、污染小，获得的PMA 均为β 型、具有相对较高的分子量（6～11 kDa）和纯度，分离过程简单，可以减少石油资源消耗和CO2排放。FENG 等[17]利用细胞固定化后的A.pullulans CCTCCM2012223 进行发酵合成了约123.7 g/L 的PMA。然而，PMA 发酵工艺的总成本中，有60%来自精制碳源的制备，如此高昂的成本限制了其工业生产。利用可再生生物质作为替代碳源进行PMA 发酵成为主要的研究方向。但由于优产菌株难分离、发酵过程难控制、发酵时间长等问题，生物合成PMA 尚未形成大规模生产。

合成PMA的菌种主要有短梗霉（Aureobasidium sp.），出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、多头绒泡菌（Physarum polycephalum）和圆弧青霉菌（Penicillium cyclopium）等。其中，多头绒泡菌和圆弧青霉菌产生的PMA 较少，仅2.7～3.3 g/L，无法满足工业化生产需求，现已很少报道。NAGATA 等[18]从土壤中筛选、分离并鉴定了一种短梗霉菌株Aureobasidium sp.A-91，分别以甘露糖和葡萄糖为碳源进行发酵，合成了12 g/L 和47 g/L 的PMA。目前，主流生产菌株是出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），其合成的PMA 产量高达152.5 g/L。出芽短梗霉产生的PMA 主要以PMA-葡聚糖的结合体分泌到细胞质外。根据PMA 在丙酮中的高溶解性，通过丙酮沉淀可去除连接的葡聚糖，得到较纯的PMA。由于每株出芽短梗霉的生理特征和代谢活性不同，PMA 的生产强度存在很大差别。

3 合成阶段的影响因素

为实现PMA 发酵的优化控制，需要对发酵培养基的营养成分和发酵条件有充分的研究和认识。碳源、氮源、中和剂、pH 值、接种量等培养基条件的优化可以实现对微生物发酵代谢的控制，从而增加目标产物的积累。

3.1 碳源

碳源是发酵培养基的主要成分之一，为微生物生长提供能源和用以合成菌体生物量的骨架，同时作为底物供菌体合成目的产物。研究发现，各种糖如葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖以及可溶性淀粉、甘油都可以被作为摇瓶中PMA 生产的碳源[19-21]。其中，葡萄糖和蔗糖为碳源时的PMA产量最高，其次是木糖、果糖和麦芽糖。甘油[22]、有机酸[23]、醇等都可被出芽短梗霉用作碳源发酵并刺激PMA 生产。殷海松等[24]发现添加氨基酸也可被菌体作为碳源吸收利用，如天冬氨酸、亮氨酸、缬氨酸和苏氨酸促进了A.pullulans CGMCC3337 菌体生长和PMA 的生产，在最优组合的氨基酸条件下获得了57.89 g/L 的PMA，比未添加氨基酸时提高了40.92%。

3.2 氮源

氮源在菌体生长过程中用于构成细胞组分如酶类、蛋白质[25]，同时也作为含氮代谢物合成的底物如氨基酸。研究发现，有机氮源（酵母提取物、胰蛋白酶、玉米浆和丁二酸铵等）对PMA 产量的影响无显著差异[20]，而无机氮源（NH4NO3、NaNO3、NH4Cl 等）对PMA 合成有显著影响[26]。而且，氮源的量或碳氮比对菌体生长和PMA 的生产有决定性的影响。WANG等[27]发现0.1 g/L NH4NO3无法满足发酵前期的细胞生长需要，添加10 g/L NH4NO3时的细胞生长迅速，但发酵结束时仍有未被消耗的NH4+，且不利于PMA生成，当在低氮时（2 g/L），PMA 产量最高。生物质来源的底物一般本身含有天然氮素，能刺激菌体生长繁殖。LEATHERS 等[28]利用A.pullulans 50383 在含最低总氮含量的大麦秸秆水解物中获得了更高的PMA 产量。CHENG 等[29]用玉米浆作为氮源，发现补充甘蔗汁或大豆糖蜜会降低PMA 产量，因为过多的氮源促进了细胞生长而不是PMA 合成。

3.3 pH 值和中和剂

培养基的pH 值会直接影响到微生物菌体细胞膜的通透性，从而影响微生物对培养基内营养物质及微量元素的吸收利用。A.pullulans 适合在酸性环境中生长，但pH 过低也会影响PMA 合成。研究发现，培养基初始pH 值为4.0～6.0 时，有利于PMA 的合成[11]。靳挺等[30]研究了初始pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）对发酵的影响，随着pH 的升高，PMA 产量逐渐增加，并在初始pH 值为5.5 时，PMA 的最高产量达16.58 g/L。CAO 等[31]研究发现，控制pH=6.0 及溶解氧浓度大于70%，能显著促进A.pullulans ipe-1 酵母形态细胞的比例，并提高PMA 的浓度，且在pH＜5时，PMA 被水解了，同时多糖增加。LI 等[32]发现，在pH 为3 的 条 件 下，A.pullulans NG 会 形 成 厚 垣 孢子，抑制PMA 的产生。PMA 呈酸性，在发酵过程中随着PMA 的积累，发酵液的pH 会大幅降低。因此，需要加入中和剂以维持pH 平衡。

在传统发酵工艺中，CaCO3是最普遍使用的中和剂，能维持发酵液pH 稳定在适合菌体生长的范围[27]。外源性Ca2+可以增加短梗霉酵母样细胞的形成，从而减少酵母细胞向菌丝体的转化。CaCO3的加入可诱导L-MA 的生成切换到还原途径，并导致用于PMA 生产的L-MA 的积累。此外，CaCO3以HCO3-的形式提供CO2，为微生物CO2固定提供了充足的底物。

3.4 接种量

接种量决定了A.pullulans 在摇瓶发酵培养中的生长繁殖速度，接种量越大，发酵瓶内A.pullulans繁殖达到高峰的时间越短，PMA 得率越高。但是，如果接种浓度过高会导致溶解氧不足，影响产物的合成，产生过多代谢废物；接种浓度过低则会延长培养时间，并降低发酵产量。在实际生物发酵过程中，菌株种类、培养基配方、其他发酵条件等都会影响接种量的变化。李睿颖等[33]对高细胞通透性的A.pullulans TJZK-BA21682 生产PMA 发酵过程中的接种量进行了优化，得出其最佳接种量为8%，当接种量过大或过小都会抑制PMA 的合成。

4 木质资源生物转化PMA 的研究进展

木质资源的成分主要为纤维素、半纤维素及木质素，也存在少量果胶、树胶、藻胶和琼脂等，其结构非常复杂[34]。在新型生物能源发酵技术中，木质资源中的纤维素和半纤维素具有非常高的利用价值。纤维素链经纤维素内切酶、外切酶与β-糖苷酶水解后可产生大量葡萄糖[35]。而半纤维素可被水解转化成丰富的单糖如己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖），以及含量很低的鼠李糖和果糖。利用废弃木质资源作为底物发酵生产PMA 成为广大科技工作者的研究重心，因为，该原料不仅成本低廉，而且由其转化合成的PMA 产量最高可达114.4 g/L，产物分子量与用精制糖发酵时的基本一样，具有极高的经济效益。目前，已经有研究将大麦秸秆、小麦秸秆、玉米、玉米芯、大豆壳、甘蔗渣、生甘薯、菊芋茎块等可再生木质资源制备成可发酵糖，代替精制碳源应用于PMA 的低成本发酵生产，如表1 所示。

表1 出芽短梗霉利用不同木质资源生产PMA

CHENG 等[29]发现A.pullulans ZX-10 将大豆糖蜜中的所有碳水化合全部转化为PMA，且在氮限制发酵中的PMA 产量为71.9 g/L，得率为0.69 g/g。WEI 等[36]发现甘蔗汁可以作为经济的底物，发酵过程中无需任何预处理或营养补充，获得了116.3 g/L的高PMA 效价和0.41 g/g 的得率。LEATHERS 等[28]利用碱性H2O2预处理后的玉米纤维和小麦秸秆作为唯一碳源合成了20 g/L 以上的PMA。ZAN 等[37]利用廉价的生甘薯水解物作为底物，在有氧纤维床生物反应器中合成了最高产量为57.5 g/L 的PMA。ZOU 等[38]发现，由农业废弃物玉米芯制备的水解液可以很好地用于分批发酵生产28.6 g/L 的PMA。XIA 等[39]使用经简化后的菊芋茎（JA）水解物组成的培养基，发现JA 提高了丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶活性，从而获得了比葡萄糖培养基更高的PMA浓度（114.4 g/L），而且在不添加外源氮源下，预处理后JA 中的生产率比单一葡萄糖高了2 倍。YEGIN等[40]使用稀酸预处理的大麦秸秆制备了一种水解液，其总发酵糖可达94.60 g/L，并且促进PMA 产量达35.76 g/L，得率为0.39 g/g。XIA 等[41]利用农产工业废渣通过固态发酵的方法由A.pullulans HA-4D从甘薯渣和麦麸（质量比1∶1）的混合底物生产PMA，最高产量达75.4 mg/g。CAO 等[42]以甘蔗渣水解液为原料合成PMA，发现将酸和酶水解产物混合不利于PMA 的生产。利用甘蔗渣酶水解产物生产PMA 的产量比由酸水解产物获得PMA 的产量高25.4%，说明酸水解产物更有利于微生物细胞生长，对PMA 产量的增加没有显著影响。WANG 等[43]选择具有高营养价值和低成本特性的玉米浸液作为生长因子发酵合成PMA，在添加3 g/L 玉米浸液后，PMA的产量和微生物细胞生长分别提高了32.8%和41.8%。

5 总结与展望

PMA 是一种非常有前途的高分子聚合物，具有广泛的应用前景，然而碳源的高成本和低产物得率使得大多数研究依然停留在实验室阶段，阻碍了PMA 的大规模生产。基于此，研究者探索了以成本低廉的木质资源为碳源底物生物转化PMA 的潜力，取得了显著成效。但还存在一些问题和挑战：

（1）由于木质素的存在，大部分来源于木质资源的原料在进行水解预处理时会产生许多木质纤维素抑制物（如糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、甲酸等），这类物质对微生物的生长和代谢具有明显的抑制作用。为了去除或减少这些消极影响，一般需要通过化学还原、物理吸附或加入生物酶的方法对水解液进行解毒。这增加了成本负担，还存在糖损失、废料和抑制物回收困难等问题，使用的化学试剂和吸附树脂也对环境造成了一定压力。

（2）大部分来自农业副产物的废材本身含有复杂的重金属离子、油脂和农药残留，从而造成可发酵糖转化率低和糖酸转化率低等问题。而玉米、甘薯这类农业作物富含淀粉，是A.pullulans 代谢的优质碳水化合物，能够产生高效价的PMA（10.1～123.7 g/L）。但是，这类农业生物质是全球范围的主要粮食作物，需求量极大，不太适合于PMA 的商业化生产。因此，开发低毒、低成本、高营养且不与食品供应链竞争的木质生物质碳源是今后研究的主要方向。