基于D值法的烟草苗期抗旱评价方法研究及抗旱材料筛选

陈 刚, 喻奇伟, 熊 晶, 舒彦淇, 陆安彬, 龙本山, 刘仁祥

(1.贵州大学农学院/贵州省烟草品质研究重点实验室, 贵阳 550025; 2.贵州大学烟草学院/贵州省烟草品质研究重点实验室, 贵阳 550025;3.贵州省烟草公司毕节市公司, 贵州 毕节 551700)

干旱是影响作物生长的主要非生物胁迫因子之一,干旱胁迫会导致作物减产50%甚至于全年失收[1]。烟草 (NicotianatabacumL.)起源于热带,整个生育期需水量较大[2-3]。干旱胁迫会影响烟叶生长发育,导致产量降低与品质下降[4-5]。烟草是我国西南地区乡村振兴的重要经济作物,而西南地区春旱时常发生,对烟叶产量和质量产生了明显的不利影响[6]。因此,选择和培育苗期烟草抗旱品种对我国烟叶生产具有重要意义。作物的抗旱性是干旱胁迫下多种生理代谢作用的结果,难以用某种单一的指标来对其进行评价[7-8]。目前,对抗旱性进行评价主要是通过综合评价法[9]。在综合评价中,抗旱系数(DC)能够消除各指标量纲差异,还能表示各材料在某个指标上的抗旱性强弱[10]。此外,评价指标的选择和各指标的权重尤为重要,抗旱性度量值(D)充分考虑了干旱胁迫下各指标的权重,是一种可靠的评价方法[11]。蔡建国等[12]采用D值法对绣球进行抗旱性评价,并构建了绣球抗旱性评价方法。目前,D值法在烟草苗期抗旱性评价研究中已有报道[13],但烟草苗期抗旱性评价方法相关研究鲜有报道。前期,本课题组观察到NC82×毕纳一号组合的多个高世代株系对干旱胁迫表现出明显的抗性差异,但各株系的抗旱性有待准确鉴定,尤其是苗期抗旱性快速评价方法有待建立。为此,本研究从NC82×毕纳一号组合的F6及以上高世代品系中,选择在田间干旱条件下表现出明显差异的21个品系,以其5叶1心的烟苗为材料,采用PEG-6000模拟干旱处理,通过测定叶绿素a等10项指标,构建了烟草苗期抗旱性评价方法,对参试材料的抗旱性进行了评价,以期为烟草抗旱品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为NC82×毕纳一号组合的F6及以上高世代品系,根据田间抗旱性观察结果,选择抗旱性差异明显的21份材料。材料由贵州大学贵州省烟草品质研究重点实验室提供。

1.2 试验设计

试验设置干旱胁迫(15% PEG-6000模拟干旱)和正常对照2个处理,各3个重复,每重复5株。试验于2021年在贵州大学烟草学院光照培养室进行,采用漂浮盘育苗,待苗长至4叶1心时将苗从漂浮盘上取出,将根洗净后水培至5叶1心时进行模拟干旱处理,处理48 h取烟苗倒二叶鲜样于液氮中暂存,取样结束后于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3 测定指标与方法

叶片相对含水量(RWC)测定采用称重法[14],叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量采用95%乙醇浸提法[15],MDA含量采用硫代巴比妥酸法[16],Pro含量采用茚三酮法[17],SOD、POD、CAT活性分别使用苏州格锐思生物科技有限公司的酶活试剂盒测定,H2O2含量使用南京建成生物科技有限公司试剂盒测定。

1.4 数据处理与统计分析

利用Excel2016软件对试验数据进行整理分析,用DPS7.05软件对数据进行相关性分析、主成分分析、聚类分析和通径分析。参照李纪潮等[18]和郑巨云等[19]方法,分别计算各单项指标的抗旱系数(DC)、隶属函数值(μ(Xi))和抗旱性度量值(D)。计算公式如下:

DC=干旱胁迫测定值/对照测定值

(1)

(2)

负向指标的隶属函数值:

(3)

式中,Xi、Xmin和Xmax分别为第i个综合指标及该指标的最小值和最大值。

(4)

(5)

式中,ωi表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度,Pi为第i个综合指标的贡献率。

2 结果与分析

2.1 各单项指标的抗旱系数分析

由表1可知,干旱胁迫下,烟草苗期的10项生理指标变异系数在7.7%～75.6%之间,说明21份材料的各项生理指标对干旱胁迫的响应存在明显差异。其中,类胡萝卜素、MDA、H2O2、CAT、Pro的变异系数均在40.0%以上,分别为75.6%,44.0%,42.6%,41.9%和44%,说明这5项指标干旱胁迫后变化较大。而POD和叶片相对含水量的变异系数均小于20.0%,分别为9.8%和7.7%,说明POD和叶片相对含水量受干旱胁迫影响较小。此外,干旱胁迫后10项生理指标抗旱系数均值在0.837～2.388之间,10项指标在干旱胁迫下变化有所不同,其中,除叶绿素a、叶绿素b、POD及叶片相对含水量外其他指标均值均大于1,说明干旱胁迫下烟草叶绿素含量降低、叶片失水,而活性氧增加导致细胞膜受到破坏。同时,为适应干旱胁迫,烟草幼苗内渗透调节物质增加以维持细胞渗透压并通过激活抗氧化酶系统(SOD、CAT)来清除活性氧,维持干旱胁迫下的正常生长。进一步观察21个材料各指标的抗旱系数发现,干旱胁迫后同一指标在不同材料间变化趋势有所不同,如干旱胁迫后SOD在1号、4～5号、8号、16～17号、19号、21号材料中降低,而在2～3号、6～7号、9～15号、18号、20号材料中上升。说明21份材料对干旱的响应存在差异,而各指标在不同材料中的变化趋势和程度不同,很难用单一的指标来判断各材料间的抗旱性差异,应当用多个指标对各个材料的抗旱性进行综合评价。

表1 干旱胁迫后各指标抗旱系数Table 1 Drought resistance coefficient of indicators after drought stress

2.2 抗旱性评价指标筛选

由于不同材料间各指标变化趋势不一致,采用单一指标对供试材料进行抗旱性评价具有片面性,因此需要多指标综合考虑。通过各指标相关性分析(表2)表明,叶绿素a与类胡萝卜素呈极显著正相关,与CAT呈极显著负相关;叶绿素b与类胡萝卜素呈显著正相关,与CAT呈显著负相关;类胡萝卜素与CAT呈显著负相关; H2O2与Pro呈极显著正相关;叶片相对含水量与H2O2呈极显著负相关,与Pro呈显著负相关。这说明10项生理指标中存在相互关联,反映烟苗对干旱胁迫的响应存在信息重叠,因此需对这10项指标进行主成分分析,用以筛选抗旱性评价指标。

表2 各指标相关性分析Table 2 Correlation analysis of indicators

对21份烟草材料10项生理指标进行主成分分析,结果(表3)表明,前5个主成分的贡献率分别为31.329%,22.339%,14.206%,9.442%和8.562%,累积贡献率达到85.877%,特征值的累积贡献率超过80.000%,说明前5个主成分能够有效反映材料85.877%的抗旱性信息,因此将前5个主成分作为21份烟草材料苗期抗旱性评价的主要因子。在主成分1中叶绿素a含量具有较高的载荷量(0.538),在主成分2中H2O2含量具有较高的载荷量(0.576),在主成分3中MDA含量具有较高的载荷量(0.663),在主成分4中SOD活性具有较高的载荷量(0.674),在主成分5中,除MDA外,POD活性具有较高的载荷量(0.549)。综合主成分分析,分别选择5个主成分中载荷量较高的指标(叶绿素a、H2O2、MDA、SOD、POD)作为烟草苗期抗旱性评价指标。

表3 各指标主成分分析Table 3 Principal component analysis of each indicator

2.3 烟草苗期抗旱性评价方法构建

以抗旱性度量值(D)作为评价标准,D值越大,代表供试材料抗旱性越强。由表4可以看出,21个材料的抗旱性存在明显差别,供试材料的D值在0.301～0.858之间,其中D值最大的为2号材料,D值最小的为1号材料。

表4 供试材料抗旱性评价的D值Table 4 D value of drought resistance evaluation of test materials

为探究烟草苗期抗旱性快速评价方法,以D值作为因变量,以筛选出的5个指标的抗旱系数作为自变量进行通径分析,得到关于D值与各指标抗旱系数的回归方程(表5)Y=0.044+0.471X1-0.065X2-0.106X3+0.068X4+0.305X5,其中,X1～X5分别代表叶绿素a、MDA、H2O2、SOD和POD。回归方程的决定系数分别为R2=0.999,p=0.000 1达到极显著水平,说明该回归方程拟合度好,可以作为烟草苗期的抗旱性预测模型。由预测模型可知,干旱胁迫后叶绿素a含量、MDA含量、H2O2含量、SOD活性和POD活性对烟草苗期抗旱性具有显著影响,可以作为烟草苗期抗旱性评价的指标。由表6可知,干旱胁迫后叶绿素a含量(X1)与D值呈极显著相关性,表明干旱胁迫后叶绿素a含量(X1)对D值的直接作用大于间接作用总和,对D值起主要作用,而其余指标对D值的贡献主要是通过干旱胁迫后叶绿素a含量间接实现,因此可以将叶绿素a作为烟草苗期抗旱性评价的关键指标,通过比较各材料叶绿素a的抗旱系数可以对烟草苗期抗旱性进行快速评价。

表5 供试材料的抗旱性模型预测Table 5 Drought resistance model prediction of test materials

表6 各综合指标的通径分析Table 6 Diameter analysis of each comprehensive indicator

2.4 烟草苗期抗旱材料筛选

利用构建出的抗旱性预测模型(Y)和快速评价指标叶绿素a的抗旱系数(DCChla)对供试材料进行抗旱性评价(表7),两种方法各材料顺序相似,部分材料排名不一致,表明通过比较各材料叶绿素a的抗旱系数可以对烟草苗期抗旱性进行初步评价,利用叶绿素a可以将抗旱性差异较大的材料筛选出来,但差异较小的材料仍需抗旱性模型进行评价。

表7 两种方法评价结果Table 7 Evaluation results of the two methods

分别对21份材料的预测模型值(Y)和叶绿素a的抗旱系数(DCChla)进行聚类分析(图1),两种方法均可将21份材料分为5类,分别为高抗、中抗、抵抗、不抗和敏感型。综合两种分析结果,在高抗和中抗两种类群中筛选出同时出现的2号、4号、6号和19号抗旱性较强的材料,作为抗春旱品种选育的种质资源。

注:左为Y值,右为DCChla。图1 21份材料D值聚类分析Fig.1 Cluster analysis of D values of 21 materials

3 讨 论

3.1 烟草苗期对干旱胁迫的生理响应

干旱胁迫会导致烟草的生长发育受到影响。Han等[20]研究指出,干旱胁迫下烟草幼苗内活性氧(H2O2)增多,活性氧会对蛋白质、脂类和脱氧核糖核酸造成氧化损伤,从而损害细胞的正常功能[21];细胞膜受到破坏,MDA含量增多;叶片水分流失、叶绿素及类胡萝卜素含量降低,光合速率减弱,从而导致烟草幼苗生长发育缓慢。此外,梁栋等[22]指出,干旱胁迫还会加快烟苗细胞程序性死亡(PCD)的进程,且干旱敏感品种较抗旱品种发生细胞程序性死亡(PCD)时间较早。为应对干旱胁迫,烟草通过多种生理代谢过程来减少水分流失和活性氧损伤,Jha等[23]通过SbCDR基因在烟草中的过表达研究发现,过表达植株较野生种具有较强的抗旱性,且转基因烟草植株中Pro及可溶性糖含量显著高于野生种;Khan等[24]研究表明,干旱胁迫后,烟草中抗氧化酶(POD,CAT,APX)活性和原性保护物质(AsA)含量抗氧化酶相关基因的转录水平(CAT,APX1和GR2较高),抗氧化酶活性增加能够有效地消除细胞中的活性氧,降低细胞氧化损伤。本研究发现,干旱胁迫导致叶片失水,叶片含水量降低,同时H2O2含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性及Pro含量升高,这说明干旱胁迫对烟草幼苗的生理代谢造成损伤之后,烟草通过激活抗氧化酶和增加细胞渗透调节能力来响应干旱。光合色素的变化在干旱胁迫的不同时间有所不同,在短时间(48 h)干旱胁迫下叶绿素含量普遍降低,这与Han等[20]研究结果一致。而汪志威[25]和吴迪等[26]研究则表明,长时间(8 d)干旱胁迫下,叶绿素含量增加。这可能是由于早期干旱胁迫导致叶绿素被破坏,而经历持续干旱胁迫后,叶绿素也能够作为一种响应因子来降低干旱胁迫损伤,而具体的响应机理目前鲜有报道,因此还需进一步深入研究。

3.2 烟草苗期抗旱性评价

作物的抗旱性是多种生理响应机制共同作用的结果,因此对作物抗旱性进行评价时,评价指标的选择尤为重要[27-28]。目前对于抗旱性评价指标的筛选已有大量研究,但指标筛选的方法各有不同。如郭莹等[29]通过灰色关联度分析指出,灌浆期不同麦类种质的荧光系数与抗旱指数关联度最高,可以利用荧光系数来评价不同麦类种质灌浆期抗旱性。程少波等[30]利用主成分分析指出,活力指数和根长是评价多花黑麦草萌发期抗旱性强弱的关键指标。在这些方法中,主成分分析能将各抗旱指标进行综合简化,客观评价各指标权重,避免主观随意性,是一种客观的指标选择方法[31]。在烟草中,汪志威[25]和吴迪等[26]通过各指标与隶属函数值的相关关系分析,指出叶绿素a等可以作为烟草苗期抗旱性评价指标。本试验通过对10项生理指标进行主成分分析,选择出5个指标用作烟草苗期抗旱性评价的重要指标,在前人研究基础上又筛选出了活性氧(H2O2)和抗氧化酶(POD)两个评价指标,完善了烟草苗期的抗旱性评价指标筛选。

通过筛选出来的指标对供试材料进行抗旱性评价,目前,对作物的抗旱性评价主要包括模糊隶属函数、抗旱性度量值法(D)等评价方法。在众多评价方法中,汪灿等[11]研究认为,D值的评价结果与田间表现更接近,是一种更可靠的评价方法。盛伟等[32]利用D值法对41份木豆材料进行抗旱性评价并筛选出11份高抗旱性材料。闫成川等[33]也用D值法筛选出了包括JK625等14份陆地棉花铃期抗旱材料。在烟草抗旱性研究中李显航等[13]利用D值法筛选出烟草苗期高抗旱性品种TN90和红花大金元,而烟草的抗旱性评价方法构建相关研究鲜有报道。本试验利用D值法对21份烟草材料苗期抗旱性进行综合评价,基于D值构建烟草苗期抗旱性评价模型(Y=0.044+0.471X1-0.065X2-0.106X3+0.068X4+0.305X5,其中,X1～X5分别代表叶绿素a、MDA、H2O2、SOD和POD)和快速评价指标(DCChla)。通过模型和快速评价指标将21份材料分为高抗型、中抗型、低抗型、不抗型和敏感型,从21份材料中筛选出4份苗期抗旱性较强的烟草材料。

4 结 论

本试验通过对干旱胁迫后21个材料的生理指标进行综合评价,从10个生理指标中筛选出叶绿素a、H2O2、MDA、SOD和POD等5项指标用作烟草苗期抗旱性评价指标。构建了烟草苗期抗旱性评价模型,模型表明,叶绿素a与烟草苗期抗旱性直接相关,说明通过干旱胁迫后叶绿素a的变化可以对烟草苗期抗旱性进行初步评价。利用两种快速评价方法将21个供试材料分为高抗型、中抗型、低抗型、不抗型和敏感型5种类型,筛选出4份烟草材料作为烟草苗期抗旱育种的种质资源,本研究为烟草苗期抗旱品种筛选与抗旱新品种的选育提供理论依据。