甜瓜松散型胚性愈伤组织诱导

易元慧, 许丁帆, 董洪雨, 刘艳军

(天津农学院园艺园林学院, 天津 300384)

甜瓜(CucumismeloL.)为葫芦科一年生蔓性草本植物,又名哈密瓜、香瓜等。甜瓜可溶性糖含量高,且含有维生素C、蛋白质等营养物质[1]。近年来,中国的甜瓜国际贸易发展迅速,但市场上抗逆性强的优良品种较少,优良种质资源的缺乏使得生产成本不断增加、生产技术难以支撑,制约了中国甜瓜产业国际竞争力的提升[2]。国内外对甜瓜的研究主要是栽培技术以及选种育种等方面[3-7],有关甜瓜的愈伤组织研究也较多,但多采用器官诱导不定芽等建立再生体系[8-12],这种再生苗生长势弱,遗传稳定性低,大大制约了种质资源创新、诱变育种等技术的发展。松散型胚性愈伤组织是具有独特性质的愈伤组织,主要由彼此联系且松散的愈伤组织细胞构成,特点是其具有一定的胚性,即这些细胞可以在一定条件下经过分化与分裂,逐步发育成胚状体,进而形成一个完整植株。形成的再生体系能为植物组织脱毒、转基因育种等研究提供平台,从而有效解决甜瓜生产中枯萎病、炭疽病等[13-14]病虫害以及坐果、含糖量等[15-16]问题。

松散型胚性愈伤组织的诱导是组织培养方法的一大创新,目前未见甜瓜松散型胚性愈伤组织诱导的相关报道。本研究以甜瓜成熟叶片为外植体,诱导甜瓜松散型胚性愈伤组织,建立高效的甜瓜松散型胚性愈伤组织诱导体系,为甜瓜种质资源创新、植物组织脱毒、人工种子研制及遗传转化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

本试验选用天津津润益农公司提供的薄皮甜瓜。截取一段已开花结果的甜瓜叶片作为外植体。

1.2 方 法

1.2.1外植体制备与消毒

用自来水将甜瓜叶片表面冲洗干净,剪下备用。在超净工作台中将叶片剪成小块,用70%乙醇浸泡2 s,再用2%的次氯酸钠溶液浸泡10 min,消毒期间不断摇晃,充分消毒。消毒后用无菌水将叶片表面冲洗干净,去除次氯酸钠残留。将洗净的甜瓜叶片用无菌滤纸吸干表面水分备用。

1.2.2愈伤组织的诱导

以MS+7.0 g/L琼脂为基本培养基,附加不同质量浓度的激素和蔗糖,pH值调节到5.8。

将消毒处理后的甜瓜叶片在超净台中剪成大小0.5～1.0 cm的小块,并将其接种到MS培养基上进行愈伤组织诱导。接种的甜瓜叶片背面朝上,保证叶片与培养基紧密接触。每个三角瓶中接种5～8块外植体,每个处理接种10瓶,重复3次。30 d后统计愈伤组织诱导率。

1.2.3松散型愈伤组织的诱导

以MS+30 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂为基本培养基,附加不同质量浓度的激素,pH值调节到5.8。

将诱导出的甜瓜愈伤组织从叶片外植体上切下,转接到含有不同激素的MS培养基上进行松散型愈伤组织诱导。每瓶接种5块,每个处理接种10瓶,重复3次。经过3次继代后,统计愈伤组织诱导情况。

1.2.4胚性愈伤组织诱导

以MS+7.0 g/L琼脂为基本培养基,附加不同质量浓度的激素和蔗糖,pH值调节到5.8。

将诱导的甜瓜松散型愈伤组织转接到含有不同激素的MS培养基上,进行松散型胚性愈伤组织诱导。每瓶接种5块,每个处理接种10瓶,重复3次。15 d后,结合压片观察选择结构松散且细胞个体小,细胞质浓度高,外形为球状的愈伤组织团进行继代转接。5次继代培养后,统计愈伤组织诱导情况。

1.3 培养条件

试验过程中培养基均采用100 mL广口三角瓶为容器,每个三角瓶加入约30 mL的培养基,pH值调至5.8～6.0,121 ℃、0.1 MPa下灭菌30 min。培养条件均为24 h光照,光照强度为2 000 lx,培养温度为(23±2)℃。

1.4 数据统计分析

试验数据采用Excel2013软件统计分析。

愈伤组织诱导率/%=(形成愈伤组织的外植体数/外植体总数)×100%;

胚性愈伤组织诱导率/%=(核占比大于30%的细胞数/总的细胞数)×100%。

用测微尺分别测量被观测细胞核与细胞的直径,再计算比值。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导情况

接种甜瓜叶片后,大约培养10 d,在叶片伤口部位有明显愈伤组织。从表1可知,在不添加任何激素处理下,外植体出愈率为12.25%,显著低于其他处理,随着培养时间增长,叶片变黄,伤口褐变。在添加2,4-D的培养基中均能诱导出愈伤组织,且2,4-D浓度为2.0 mg/L时愈伤组织诱导速度较快,在接种5 d后叶片体积膨大,15 d左右有明显愈伤组织形成。降低蔗糖含量至20 g/L能有效地提高叶片诱导愈伤速度,培养10 d后有大量愈伤组织形成。在2,4-D的作用下诱导出的白色且结构松散、质地较软的松软型愈伤组织,后期多数会褐变死亡。加入一定量的分裂素能有效控制褐变情况,当6-BA浓度为0.1 mg/L时(图1),愈伤组织呈黄绿色且结构松散、质地较硬,具有多种应用方向,可以持续诱导,产生不同类型的愈伤组织。但从愈伤组织生长速度和形态来看,蔗糖用量与分裂素配合使用都会对诱导结果产生较大的影响。因此,理想的甜瓜愈伤组织诱导培养基为:MS+0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+20 g/L蔗糖。

表1 不同培养基对甜瓜叶片外植体愈伤组织诱导结果Table 1 Callus induction results of Cucumis melo L. leaf explants in different media

2.2 松散型愈伤组织诱导情况

从表2可以看出,在原培养基上持续诱导,会使得愈伤组织质地变软,随着分裂素的增加,愈伤组织质地越来越硬,过高浓度的分裂素使得生长速度变慢,且结构变得紧密。与6-BA相比分裂素KT与2,4-D组合诱导的愈伤组织生长速度慢且结构更加紧密,质地硬,颜色呈黄色(图2A1),细胞组织化严重(图2A2),达不到理想的松散状态。而0.5 mg/L的6-BA与2.0 mg/L 2,4-D结合处理下可以诱导出松散型的愈伤组织,但高浓度的2,4-D会使得愈伤组织快速生长,细胞分裂减少,体积膨大,形成细胞核较小的大细胞(图2B1),导致愈伤组织稀软(图2B2),不利于后期愈伤组织的胚性化。当降低2,4-D浓度至1 mg/L时,结合0.1 mg/L低浓度的6-BA愈伤组织(图2C1)呈现出结构松散、质地软的状态且颜色为黄白色,而压片观察发现细胞体积大都呈长条形,核占比小(图2C2)。当2,4-D浓度为1 mg/L时,提高分裂素6-BA能改变愈伤组织质地,当6-BA浓度为0.5 mg/L时,愈伤组织结构松散、质地较硬,且生长速度较快,呈黄绿色(图2D1),显微镜下细胞近似圆形,体积适中,数目较多(图2D2)是松散型愈伤组织的最佳状态。综上所述,理想的甜瓜松散型愈伤组织诱导培养基为:MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖。

图1 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D下诱导的松软型愈伤组织 Fig.1 Soft callus induced under 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D

注:A1为外源激素KT作用下愈伤组织;A2为A1对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);B1为高浓度(2.0 mg/L)2,4-D下诱导的愈伤组织;B2为B1对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);C1为0.1 mg/L BA+1.0 mg/L 2,4-D下诱导的愈伤组织;C2为C1对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);D1为理想的甜瓜松散型愈伤组织;D2为D1对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm)。图2 不同外源激素下诱导的愈伤组织状态以及细胞学鉴定Fig.2 Callus state induced by different exogenous hormones and cytological identification

表2 不同激素配比对甜瓜松散型愈伤组织的影响Table 2 Effects of different hormone ratios on loose callus of Cucumis melo L.

2.3 松散型胚性愈伤组织诱导情况

将甜瓜松散型愈伤组织转接到胚性愈伤组织诱导培养基上,培养一段时间后,愈伤组织质地变得较硬,颜色加深,外表光滑,不同培养基下愈伤组织外观差异不大,但经显微镜检查发现,愈伤组织细胞的形态和特性有明显差异。从表3可知,在原培养基的基础上,降低2,4-D浓度,愈伤组织生长速度逐渐减慢,质地逐渐变硬,当2,4-D浓度为0.25 mg/L时,愈伤组织出现少量胚性细胞(图3A1)所示,胚性愈伤组织诱导率为18.75%,显著高于原培养基的诱导率。但愈伤组织质地硬,游离细胞少,多数组织化,颜色呈发黄且生长速度慢,老化快(图3A2)。单一的降低2,4-D浓度可以诱导产生部分细胞胚性化,但相对高浓度的6-BA就会降低愈伤组织生长速度,导致愈伤组织质地过硬,出现组织化的现象。当6-BA浓度为1.0 mg/L,2,4-D浓度为0.5 mg/L时胚性愈伤组织诱导率为15%,显著高于1,2,3组处理,但愈伤组织生长状态与2,4-D浓度为0.25 mg/L时相同,压片观察不同视野下,细胞总数少。从而说明胚性愈伤组织的诱导不仅需要调节6-BA与2,4-D浓度的高低,二者比例大小的调节也至关重要。当2,4-D浓度为0.5 mg/L时,随着6-BA浓度的降低愈伤组织生长速度逐渐加快,降至0.25 mg/L时,愈伤组织结构松散,质地较硬,生长速度较快呈黄绿色(图3B2),但胚性愈伤组织诱导率较低,细胞多数进行无丝分裂形成体积较大,核较小的大细胞(图3B1)。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上诱导时发现降低6-BA浓度能加快生长速度,细胞数量增多(图3C1、C2),但胚性愈伤组织诱导率与在0.5 mg/L6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上诱导的无差异。配合蔗糖用量的改变,调节培养基的渗透压,能有效控制愈伤组织生长速度以及胚性化程度。提高蔗糖用量,增加培养基渗透压利于愈伤组织细胞向着胚性转变。当蔗糖提高到40 g/L时,胚性愈伤组织诱导率显著提高,添加浓度为0.25 mg/L 6-BA以及0.5 mg/L 2,4-D时,愈伤组织颜色加深,生长速度较快,细胞数量增多,细胞体积小,核占比较大(图3D1、D2),胚性愈伤诱导率为33.58%,显著高于同样激素下30 g/L蔗糖的诱导率。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖培养基上继代培养4～5代后可明显观察到愈伤组织细胞变小、细胞质浓度增大和细胞核加大等胚性细胞的一些特征(图3E1、E2),胚性愈伤诱导率显著高于其他处理,达69.44%。综上试验结果,理想的甜瓜松散型胚性愈伤组织诱导培养基配方为:MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖。

注:A1为A2对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);A2为0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下诱导的愈伤组织;B1为B2对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);B2为0.25 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D下诱导的愈伤组织;C1为C2对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);C2为0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下诱导的愈伤组织;D1为D2对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);D2为0.25 mg/L BA+0.5 mg/L2,4-D下诱导的愈伤组织(高渗透压);E1为E2对应的愈伤组织显微观察(bar=200 μm);E2为0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下诱导的愈伤组织(高渗透压)。图3 不同激素与渗透压下诱导的愈伤组织状态以及胚性化程度的细胞学鉴定Fig.3 Callus state induced by different hormones and osmotic pressure and cytological identification for degree of embryogenesis

表3 激素与渗透压对甜瓜愈伤组织胚性化的影响Table 3 Effects of hormones and osmotic pressure on embryogenesis of Cucumis melo L. callus

3 结论与讨论

诱导胚性愈伤是一个前后连接的过程,前期愈伤组织的性质会影响后期愈伤组织的胚性化程度,因此诱导愈伤组织的选材非常关键,不同外植体诱导的愈伤其生理特性也有所不同。在甜瓜愈伤组织诱导的研究进程中,大多数研究者采用无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,魏晓明等[17]、骆开明等[18]利用子叶以及下胚轴研究不同激素对愈伤诱导率的影响;陈千红和管和[19]利用甜瓜下胚轴研究外源激素对愈伤的组织效应,王爱玲等[20]、赵燕等[21]利用子叶下胚轴建立再生体系。本研究采用了经开花结果的甜瓜茎段作为外植体,对于无菌苗的子叶以及下胚轴来说成熟的茎段生长能力以及细胞分裂能力相对较低,诱导愈伤组织的时间可能较长。如武云鹏等[22]、乔永旭[11]研究表明,子叶和下胚轴的诱导愈伤组织的速度明显高于真叶,且子叶诱导的愈伤组织生长速度最快、品质最好、数量最多。而刘丽锋等[23]研究发现,田间叶片诱导愈伤组织效率高于无菌苗叶片。考虑到甜瓜品种以及实验环境的不同从而导致二者的结论的相悖。在生产上,真叶的诱导实用性更强,取材更加直观、便捷,节约生产成本。外植体幼嫩程度也可能会在诱导出的松散型胚性愈伤形成胚状体过程中有一定影响,本次试验诱导出了松散型胚性愈伤还有待进一步研究体胚的诱导。

碳源在诱导愈伤组织过程中是必不可少的,尤其在诱导胚性愈伤过程中[25]。植物愈伤组织诱导中蔗糖在众多碳源中被普遍运用,本试验研究发现,适当升高蔗糖的浓度到40 g/L更加利于甜瓜胚性愈伤的诱导。这一现象在洋葱以及珍珠黄杨等胚性愈伤诱导上同样适用。代月等[25]研究发现,适当增加蔗糖浓度有利于洋葱胚性愈伤的诱导。李华[26]研究得出胚性愈伤组织状态调整中,最适蔗糖浓度为45～55 g/L。提高蔗糖浓度一方面增加了营养的供给,另一方面也适当增加了培养基渗透压。高渗透压下更有利于细胞体积变小,液泡浓缩,细胞核增大。研究表明,胚胎发生细胞的共同特征包括小尺寸,致密的细胞质内容物,大核,突出的增大的核,小液泡[25],根据愈伤组织状态提高蔗糖浓度能达到此种状态特征,从而高效的诱导胚性愈伤。

本试验以成熟叶片为外植体诱导甜瓜松散型胚性愈伤组织诱导,以MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖为最佳培养样基,为甜瓜快速繁殖、大规模量产、体细胞离体诱变育种及植物组培脱毒等研究提供参考。有关甜瓜胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生还在进一步研究中。