miR-149-5p 通过MSH5/Wnt 信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为

冯 毅 ，王小峰 ，白西民 ，姚 胜 ，党俊涛 ，赵云洁 ，蔡 冰

（1）渭南市中心医院神经外科;2）病理科，陕西 渭南 714000）

胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤。据报道，每年约有14 000 例新增的胶质瘤患者[1]，且老年人具有较高的发病率。尽管目前手术切除以及放化疗等医学技术取得了很大的进步，但患者的预后仍然较差，临床上仍无法彻底治愈恶性程度较高的胶质瘤。因此，探索胶质瘤的潜在发病机制，寻找新的预后标志物迫在眉睫。miRNA 是由18～25 个核苷酸组成的非编码RNA，已被广泛报道参与调节肿瘤细胞的生理过程[2-3]，通过与靶mRNA 的异常表达和交叉调节可作为肿瘤的诊断和预后标志物。例如：miR-4 319 在甲状腺癌组织和细胞中下调，抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化[4]。miR-149 是肿瘤中具有广泛调控作用的miRNA，由2q37.3 上的MIR149 基因编码。Xu B 等[5]报道，促进miR-149-5p 表达可增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的毒性。但miR-149-5p 在胶质瘤中的作用机制尚不清楚。因此，本研究将探讨miR-149-5p 对胶质瘤细胞恶性生物学行为的调控作用及其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集

收集在渭南市中心医院就诊并确诊为胶质瘤患者的肿瘤组织样本30 例，在距肿瘤组织2 cm处获得相邻的癌旁组织样本（即对照组），在收样前患者知情并签署知情同意书。采集样本的患者除手术治疗外未接受其他治疗。本研究工作遵循世界医学协会赫尔辛基宣言进行，同时获得了渭南市中心医院伦理委员会的批准（2023 研004-3）。

1.2 细胞系

胶质瘤细胞系A172（货号：CL-0012，Pricella，武汉）、U251（货号：CL-0237，Pricella，武汉）、HS683（货号：CL-0362，Pricella，武汉）、H4（货号：CBP60590，Cobioer，南京）。人正常星形胶质细胞HA1800（货号：AC340443）和293T 细胞（货号：KMCC-001-0255）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.3 主要试剂

90%高糖DMEM 培养基、DMEM 培养基购自上海中乔新舟生物科技有限公司。PrimeScript™RT 试剂盒和gDNA Eraser 购自Takara。NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和miR-149-5p inhibitor 序列合成由吉玛基因提供技术支持。MSH5 抗体购自ThermoFisher Scientific。GAPDH、GSK3β、β-catenin、AXIN2 一抗购自Abcam。Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒、胰蛋白酶、CCK-8 试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio。Hoechst33342 试剂、Wnt 通路抑制剂Triptonide 以及Wnt 通路激活剂HLY78 购自MedChemExpress。荧光显微镜购自莱卡。离心机购自深圳瑞沃德。细胞培养箱购自Eppendorf。Bio-RAD 蛋白成像系统购自上海艾研。

1.4 细胞培养

A172、U251、HS683、H4 细胞分别接种于含10% FBS、1% P/SH 的DMEM 培养基。A1800 细胞接种于含10% FBS 的高糖DMEM 培养基中。293T 细胞培养在含10% FBS、1% Glutamax 和1%双抗的DMEM 培养基内。培养基置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。

1.5 细胞转染和处理

取生长良好的A172 细胞，经胰蛋白酶消化后接种于不含抗生素的培养基中。次日，根据Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒说明书，分别将NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor、sh-NC、sh-MSH5、sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor 以及 pcDNA-MSH5分别转染至A172 细胞。待细胞培养48 h 后，分别检测转染效率，成功转染的细胞用于后续实验。转染的pcDNA-MSH5 的A172 细胞再根据试剂说明分别用Triptonide 和HLY78 处理。

1.6 RT-qPCR 实验

TRIzol 试剂提取总RNA，并使用PrimeScript™RT 试剂盒和gDNA Eraser 将1 000 ng RNA 逆转录为cDNA。使 用SYBR® Premix Ex Taq™ II 和Applied Biosystems 7 500 实时PCR 系统进行实时聚合酶链式反应。2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达。U6 作为miRNA 的内参。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 CCK-8 实验

CCK-8 用于测定细胞活力。调整细胞密度，向96 孔板的每孔中接种1 000 个A172 细胞，每孔100 μL。培养板置于5% CO2细胞培养箱中培养。在培养的第0、24、48、72、96 h 向每孔中添加10 μL CCK-8 试剂，通过酶标仪测定细胞的光密度值。

1.8 Western blot 实验

细胞在冰上含有蛋白酶抑制剂的RIPA 溶液中裂解。BCA 试剂盒检测蛋白质的浓度。将分离的蛋白质进行SDS-PAGE 凝胶电泳，随后转移至PVDF 膜 上。将膜与一抗（MSH5：0.05 μg/mL；GAPDH：1∶2 000；GSK3β：1∶2 000；βcatenin：1∶4 000；AXIN2：1 μg/mL）进行过夜孵育，再与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育2 h。经ECL 化学发光底物曝光后用蛋白成像系统采集图像。Image J 软件用于分析条带灰度值。

1.9 EDU 实验

收集对数生长期的细胞培养在96 孔板中，用100 μL 含20 μmol/L EdU 的培养基处理。在37 ℃、5% CO2环境中孵育2 h，用4%多聚甲醛分别固定各组细胞30 min，再置于含0.5% Triton-X-100 的PBS 溶液中孵育20 min。Hoechst33342 溶液染细胞核。荧光显微镜观察染色结果并拍照记录。

1.10 Transwell 检测迁移和侵袭

成功转染的细胞经胰蛋白酶消化后，收集细胞并计数。将4×104个细胞用100 μL 无血清培养基悬浮制得细胞悬液并接种至Transwell 小室上室，将含10% FBS 的完全培养基加至小室下室。Transwell 小室置于细胞培养箱中培养48 h。随后用4%多聚甲醛固定细胞0.1%结晶紫溶液染色。显微镜拍照并计数。侵袭实验接种细胞前在小室上室中加入稀释后的Matrigel 基质胶，胶凝固后再接种细胞，其余步骤与迁移实验相同。

1.11 流式细胞术检测细胞周期

取生长良好的各组细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，重悬于PBS 中。然后在冰冷的70%乙醇中过夜固定。随后，1 000 r/min 条件下将细胞离心5 min，并重悬在50 μL RNase A 中，于37 ℃下孵育30 min。将400 μL 碘化丙啶（PI）细胞悬液中混匀，孵育30 min，通过流式细胞仪进行检测。

1.12 流式细胞术检测细胞凋亡率

采用双染法Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。将转染后的细胞接种至6孔板中，加入完全培养基培养24 h。收集细胞与Annexin V-FITC 试剂在常温中避光孵育15 min，然后再与PI 溶液避光孵育15 min。通过流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.13 双荧光素酶报告基因实验

经PCR 扩增MSH5 的3′-UTR（MSH5-WT）并插入p-GL3 报告载体中，同时构建与miR-149-5p 具有靶向结合位点的MSH5 3′-UTR 突变序列（MSH5-MUT），并转入p-GL3 报告载体。将NC mimic 或miR-149-5p mimic 分 别与MSH5-WT 或MSH5-MUT 经Lipofectamine 2000 共转染至293T细胞中。转染48 h 后，通过双荧光素酶测定法分析荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性作为内部参照。

1.14 统计学处理

每组实验均进行3 次重复。GraphPad Prism8.0用于数据分析并作图。来自三个及以上独立重复实验的数据均表示为“均数±标准差”。非配对t检验用于分析2 组间的差异。单因素方差分析用于分析多组间的差异，Tukey 检验用于多组间的两两比较。P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞中的表达

收集胶质瘤患者的肿瘤组织及其对应的癌旁组织，通过RT-qPCR 检测显示，miR-149-5p 肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织（图1A，P＜0.000 1）。此外，miR-149-5p 在人胶质瘤细胞系A172、U251、HS683、H4 中的表达明显低于人正常星形胶质细胞HA1800（图1B，P＜ 0.000 1）。由此，推测miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞系中的低表达与胶质瘤的发展密切相关。

图1 miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞中的表达Fig.1 miR-149-5p was downregulated in glioma tissues and cells

2.2 miR-149-5p 对A172 细胞恶性生物学行为的影响

为进一步探索miR-149-5p 对胶质瘤细胞的作用机制，分别在A172 细胞中转染NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和miR-149-5p inhibitor。检测显示，转染miR-149-5pmimic 明显增加miR-149-5p 的表达，转染miR-149-5p inhibitor 组 中miR-149-5p 表达降 低。CCK-8、EDU、Transwell 以及流式细胞术检测表明，过表达miR-149-5p 明显抑制A172 细胞的增殖（图2B、2C 和2F，P＜ 0.01）、迁移（图2D 和2G，P＜ 0.05）和侵袭（图2E 和2H，P＜ 0.01），促进G1 期细胞比例（图3A 和3B，P＜ 0.01）以及凋亡率（图3C 和3D，P＜ 0.01）。与NC inhibitor 组相比，敲降miR-149-5p 组中细胞的增殖活力（P＜ 0.05）、迁移（P＜0.05）和侵袭（P＜ 0.05）能力显著升高，G1 期细胞比例（P＜ 0.05）以及凋亡水平（P＜ 0.05）降低。综上可知。过表达miR-149-5p 可显著抑制A172 细胞的增殖、转移和细胞周期，诱导细胞凋亡。敲降miR-149-5p 可明显促进A172 细胞的恶性生物学行为。

图2 miR-149-5p 对A172 细胞恶性生物学行为的影响Fig.2 Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells

图3 miR-149-5p 对A172 细胞恶性生物学行为的影响Fig.3 Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells

2.3 miR-149-5p 靶向MSH5

通过starbase 数据库预测发现，MSH5 与miR-149-5p 具有靶向结合序列，见图4A。双荧光素酶报告基因实验验证证实，过表达miR-149-5p可明显抑制MSH5 野生型载体的荧光素酶活性见图4B，P＜ 0.05），而对MSH5 突变型载体的荧光素酶活性无显著作用（P＞ 0.05。通过GEPIA 数据库预测显示，MSH5 在胶质瘤组织中表达降低（图4C，P＜ 0.01）。RT-qPCR 发现，过表达miR-149-5p 可抑制MSH5 的蛋白表达（图4D，P＜0.01），而敲降miR-149-5p 组A172 细胞中MSH5表达显著增加（图4E，P＜ 0.01）。由此证实，miR-149-5p 靶向负调控MSH5。

图4 miR-149-5p 靶向MSH5Fig.4 miR-149-5p targeted MSH5

2.4 miR-149-5p 靶向MSH5 调控A172 细胞的恶性生物学行为

为进一步探索miR-149-5p 调控MSH5 对A172 细胞恶性生物学行为的影响，分别在A172细胞中转染sh-NC、sh-MSH5 和sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor。Western blot 结果见图5A 和5B，转染sh-MSH5 组A172 细胞中MSH5 的蛋白表达低于sh-NC 组（P＜ 0.001），转染sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor 组中MSH5 的蛋白表达高于sh-MSH5 转染组（P＜ 0.05）。通 过CCK-8、EDU、Tranwell 和流式细胞术检测表明，敲降MSH5 可显著抑制A172 细胞的增殖活力（图5C～5E，均P＜ 0.01）、迁移（图5F 和5G，P＜ 0.01）和侵袭（图5H 和5I，P＜ 0.05），促进G1 期细胞比例（图6A和6B，P＜ 0.01）以及细胞凋亡率（图6C 和6D，P＜ 0.001）。同时敲降miR-149-5p 和MSH5 组中细胞的增殖（P＜ 0.05）、迁移（P＜ 0.05）和侵袭（P＜ 0.05）能力高于敲降MSH5 组，G1 期细胞比例（P＜ 0.05）和凋亡（P＜ 0.05）水平低于仅敲降MSH5 组。综上所述，敲降miR-149-5p 靶向MSH5，可逆转敲降MSH5 对A172 细胞恶性生物学行为的抑制作用。

图5 miR-149-5p 靶向MSH5 调控A172 细胞的恶性生物学行为Fig.5 miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells

图6 miR-149-5p 靶向MSH5 调控A172 细胞的恶性生物学行为Fig.6 miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells

2.5 MSH5 调控Wnt 信号通路对A172 细胞的作用

Wnt 信号通路被报道在胶质瘤的发展进程中发挥着重要作用，因此，笔者进一步探讨miR-149-5p/MSH5 分子轴是否通过Wnt 信号通路而调控胶质瘤的进程。分别用Wnt 通路抑制剂Triptonide 以及Wnt 通路激活剂HLY78 处理转染pcDNA-MSH5 的A172 细胞。检测结果见图7A，与pcDNA-NC 作用相 比，pcDNA-MSH5 组 中MSH5（图7B，P＜ 0.001）、GSK3β 表达降低（图7C，P＜ 0.001），β-catenin（图7D，P＜ 0.05）和AXIN2（图7E，P＜ 0.01）表达升高。与pcDNA-MSH5 组相比，pcDNA-MSH5+Triptonide 组中GSK3β 表达升高（P＜ 0.001），β-catenin（P＜ 0.05）和AXIN2（P＜ 0.01）表达降低；而pcDNA-MSH5+HLY78 组 中GSK3β 表达降 低（P＜ 0.001），βcatenin（P＜ 0.05）和AXIN2（P＜ 0.05）表达升高。过表达MSH5 且经Triptonide 处理可显著下调过表达MSH5 对A172 细胞的增殖（图7F～7H，均P＜0.01）、迁移（图7I～7J，P＜ 0.01）和侵袭（图7K～7L，P＜ 0.01）的促进作用以及对A172 细胞的G1期细胞比例（图8A～8B，P＜ 0.05）和凋亡水平（图8C～8D，P＜ 0.05）的抑制作用。过表达MSH5 且经HLY78 处理可显著上调过表达MSH5对A172 细胞的增殖（均P＜ 0.05）、迁移（P＜ 0.05）和侵袭（P＜ 0.05）的促进作用以及对A172 细胞的G1 期细胞比例（P＜ 0.05）和凋亡水平（P＜ 0.05）的抑制作用。综上表明，过表达MSH5 通过激活Wnt 信号通路促进A172 细胞的恶性表型。

图7 MSH5 调控Wnt 信号通路对A172 细胞的作用Fig.7 Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells

图8 MSH5 调控Wnt 信号通路对A172 细胞的作用Fig.8 Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells

3 讨论

胶质瘤占原发性脑肿瘤的80%，由于有空间占位效应，使患者的颅内压升高，可能导致患者呕吐、视力丧失或出现癫痫症状[6]。同时，胶质瘤具有较强的侵袭性，手术很难将病灶完全切除[7]。因此，越来越多的研究者开始研究靶向治疗，以期通过寻找有效的生物标志物为胶质瘤提供新的治疗方案。

miRNA 在基因表达中具有重要的调控作用，据估计，约有三分之一的蛋白表达受miRNA 的调控[8-9]。miR-149-5p 被证实在多种肿瘤细胞中作为抑癌因子抑制肿瘤的进程。Li Q 等[10]证明，在胃癌组织和细胞系中miR-149-5p 低表达，过表达miR-149-5p 显著抑制胃癌细胞的增殖和转移并诱导细胞凋亡。在乳腺癌细胞中，circ-0072995 通过靶向下调miR-149-5p 可促进乳腺癌细胞的恶性表型和无氧糖酵解[11]。miR-149-5p 靶向下调RGS17，抑制前列腺癌细胞的活力、增殖和迁移[12]。在本研究中，笔者发现miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞系中表达降低，过表达miR-149-5p 显著抑制胶质瘤A172 细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞G1 期的比例并诱导细胞凋亡。而敲降miR-149-5p 可促进A172 细胞的增殖和转移，抑制G1 期细胞比例以及细胞凋亡率。此外，miR-149-5p 也被报道参与炎症及代谢类疾病的调控[13-15]。例如：miR-149-5p 可抑制骨关节炎和类风湿性关节炎中促炎细胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平[15]。黄芪多糖通过上调miR-149-5p 的表达，改善高糖和棕榈酸诱导的小鼠胰腺β 细胞的增殖和胰岛素的分泌[13]。过表达miR-149-5p 显著聚集尿酸诱导的干细胞中甘油三酯的积累[16]。

MutS 同源物5（MutS Homolog 5，MSH5）是MutS 蛋白家族的成员，与MSH4 形成异二聚体复合物，参与DNA 配错修复和减数分裂重组，在DNA 双链断裂的同源重组修复过程中发挥重要作用[17]。研究发现，MSH4 和MSH5 中的遗传变异是男性不育的相关原因[18]。MSH5 突变可损害DNA 同源重组修复，可能导致非综合性原发性卵巢功能不全[19]。敲低lncRNA HCP5 抑制YB1 与MSH 启动子在的结合，抑制MSH5 的转录激活，进而抑制DNA 双链断裂的修复过程，促进卵巢颗粒细胞的凋亡[20]。本研究中，笔者发现MSH5 是miR-149-5p 的靶基因，MSH5 在胶质瘤组织和细胞中高表达，敲降miR-149-5p 靶向上调MSH5促进A172 细胞恶性表型。

糖原合成酶激酶3-β（glycogen Synthase Kinase 3-β，GSK3β）是GSK3 的两种异构体之一，可通过介导Wnt/β-catenin 信号通路参与调节糖原合成、蛋白质合成、细胞增殖、细胞分化以及免疫功能和炎症等过程[21-23]。本研究中，笔者证明，过表达MSH5 通过抑制GSK3β，促进βcatenin 和AXIN2 表达，从而促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡。

综上所述，本研究发现miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞系中低表达，敲降miR-149-5p 通过靶向上调MSH5，抑制GSK3β，促进βcatenin 和AXIN2 通路蛋白表达，进而促进胶质瘤细胞的生长和转移，并抑制细胞凋亡。