DNA 甲基化与精神分裂症的研究进展

尹文卅 ，卢玉梅 ，佟金莲 ，聂胜洁 ，阮 冶

（1）云南省精神病医院医务部;2）云南省精神卫生防治中心;3）昆明医科大学附属精神卫生中心，云南 昆明 650224;4）昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500;5）昆明医科大学研究生院，云南 昆明 650500）

据统计，全球大约有2 300 万人患有精神分裂症（schizophrenia，SCZ），与普通人群相比SCZ 患者的预期寿命减少了15～20 a[1-2]。SCZ 确切的遗传模式不清，发病机制尚未明。近年来的研究发现SCZ 是一种遗传异质性疾病，由遗传学，表观遗传学，神经生物学和环境因素等多种因素共同作用而形成[3]。通过全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）以及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等研究发现，SCZ 的发病机制与环境、遗传以及表观遗传调控（尤其是DNA 甲基化）改变基因表达有关[4-6]。

尽管SCZ 的研究逐渐增加，但目前尚未发现明确的病理生理机制、分子诊断或精确的生物学标志物。DNA 甲基化有望更好地理解SCZ 病理生理学机制，并有希望获得精确的生物学标志物。基于此，现对SCZ 中不同基因DNA 甲基化研究进行综述如下。

1 DNA 甲基化

DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸的一个甲基基团转移到DNA 分子碱基上。甲基化部位主要发生在CpG 岛的基因组中富含胞嘧啶和鸟嘌呤的片段[7]，通常在胞嘧啶残基的第5 个碳上，形成5-甲基胞嘧啶[6]。该过程由一系列DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化和维持，包 括DNMT1，DNMT3A 和DNMT3B 等多种DNA 甲基转移酶。由胞嘧啶环第5 位碳原子的共价甲基化，生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）[8-9]。由于CpG 岛通常分布在基因的启动子区域，经常出现在转录起始位点周围，所以启动子区DNA 甲基化对调控基因的转录具有重要作用，通常与基因转录活性的降低有关。

2 DNA 甲基化测序

精神分裂症是一种复杂的疾病，在DNA 甲基化方面涉及诸多基因。也有多种方法可以进行DNA 甲基化的测序。例如：

Tet-酶辅助亚硫酸氢盐测序（tet-assisted bisulfite sequencing，TAB-seq）是 一种结合Tet 酶和亚硫酸盐测序的方法。Tet 酶可以将5-甲基脱氧胞苷（5mC）转化为5-羟甲基脱氧胞苷（5hmC），而亚硫酸盐测序可以区分5mC 和5hmC。通过二者结合，TAB-seq 可以提供更详细的DNA 甲基化信息，包括5mC 和5hmC 的定位和相对丰度，在研究精神疾病DNA 甲基化动态变化和表观遗传学调控方面具有重要意义[10]。

APOBEC-偶联表观遗传测序（APOBECcoupled epigenetic sequencing，ACE-seq）是APOBEC 酶催化胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，其特异性地发生在甲基化的胞嘧啶残基上，导致5-甲基胞嘧啶（5mC）转化为胸腺嘧啶（T）。通过文库制备后进行高通量测序，对测序数据进行分析，以确定胞嘧啶脱氨事件的位置和模式，并将测序数据与参考基因组进行比较，从而确定胞嘧啶脱氨发生的具体位点。ACE-seq 可以帮助揭示胞嘧啶脱氨在DNA 损伤和修复过程中的作用，研究发育过程中的DNA 甲基化动力学、疾病进展以及对环境刺激的反应等[10]。

氧化亚硫酸氢测序（oxidative bisulfite sequencing，oxBS-seq）是一种基于氧化亚硫酸盐的测序方法。亚硫酸氢盐测序（BS-seq）是用单碱基分辨率量化DNA 甲基化的金标准，不同于传统的BS-seq，oxBs-seq 在亚硫酸盐处理之前会进行氧化处理，将5hmC 转化为5-羟甲基脱氧胞苷酸（5fC）和5-羧甲基脱氧胞苷酸（5caC），通过测序技术区分5mC、5hmC、5fC 和5caC，从而提供更全面的DNA 甲基化信息[11]。

纳米孔技术测序（nanopore technologies sequencing）下是第三代（长读）测序方法，可以读取较长的DNA 片段，与Illumina 常用的“合成测序”方法相比，纳米孔技术的测序是基于电流的微小变化[12]。在测序过程中，DNA 链穿过嵌入在聚合物膜上直径约1.8 nm 的蛋白质纳米孔，当DNA 链进入孔内时，电流根据孔内的DNA 碱基而变化，从而使得检测表观遗传变化成为可能[12]。其优点在于它具有高通量、实时性和单分子级别的分辨率，能提供全基因组信息，长读取允许检测罕见变异、缺失、插入、重复区域以及DNA 甲基化等[12-13]。对于研究精神疾病DNA 甲基化的动态变化和空间分布具有重要意义，其缺点是样品检测价格较为昂贵。

3 DNA 甲基化与SCZ

在SCZ 的发生和发展过程中，DNA 的甲基化是最早发现与SCZ 相关的表观遗传修饰之一。同时，DNA 甲基化是表观遗传学研究最为广泛的表观遗传学修饰类型。从GWAS 分析结果来看，SCZ 可能是不同基因甲基化变化的共同作用的结果[14-15]。多项研究表明，在SCZ 中发现了多个基因的甲基化异常。诸如，SCZ 存在RELN、HTR2A、SOX10等基因启动子DNA 甲基化异常。此外，还有研究发现SCZ 患者大脑皮质灰质和白质的DNA 甲基化差异显著[16]。Chen 等[17]进行的一项研究确定了血细胞中SCZ 特异性DNA 甲基化特征，并且这些特征（如背外侧前额叶皮层的甲基化差异）在尸检样本中仍可以观察到。从神经递质通路来看，SCZ 中DNA 甲基化涉及5-羟色胺、多巴胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸等多种神经递质通路。多巴胺（Dopamine，DA）、5-羟色胺（Serotonin，5-HT）、去甲肾上腺素（Noradrenaline，NA）和脑源 性神经 营养因 子（Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF）等多个基因甲基化与SCZ 明显相关[18-19]。从神经分化与发育看，Lisoway 等人关于SCZ 的研究发现SCZ 患者DNA甲基化与神经分化和发育相关基因富集方面存在显著差异[5]。早期大脑发育过程中的DNA 甲基化也与SCZ 风险有关，DNA 甲基化容易受到药理作用等环境因素的影响，可作为寻找治疗SCZ 更有效的治疗新靶点[20]。最近，在应用甲基化DNA免疫沉淀芯片研究SCZ 患者外周血单核细胞基因组DNA 甲基化失调中发现：SHANK3启动子高甲基化，且其高甲基化与左侧下叶皮质表面区域呈负相关，与首发SCZ 中阴性症状分数呈正相关。转录因子YBX1 进一步发现在诱导多能干细胞衍生的皮质中间神经元（cINs）而不是谷氨酸能神经元中与SHANK3启动子的高甲基化区结合；使用shRNAs 在cINs 中证实 了YBX1 对SHANK3 表 达的直接正向调节作用[21]。

总之，在SCZ 中，有来自不同组织的多个候选基因研究表明，不同的候选基因在SCZ 的病例对照研究中存在DNA 甲基化的差异。

4 SCZ 与不同基因DNA 甲基化

4.1 MAOA 基因

在人类中，MAOA 基因位于X 染色体（Xp11.3）上与MAOB 相邻的位置。这两个基因具有相似的外显子-内含子组成，共有16 个外显子，序列一致性约为70%。在体内体外实验中，MAOA 启动子甲基化与MAOA 表达呈负相关。甲基化机制还负责调节新发现的MAOA 相关的lncRNA，该lncRNA 抑制了大脑中的MAOA 表达[22]。此外，MAOA 基因的甲基化水平与反社会行为，暴力行为，Brunner 综合征以及SCZ 等多种行为和疾病有关。在偏执型SCZ 中，与健康男性对照相比SCZ 男性患者中MAOA 启动子CpG 位点甲基化增加也已被证实。与之类似地，学者池野田等研究团队通过焦磷酸测序技术，对5-羟色胺转运体基因（SLC6A4）DNA 甲基化进行研究，同样发现类似的性别差异，在男性SCZ 患者中SLC6A4的CpG位点显著超甲基化[23]。此外，Yang 等[18]也表明MAOA 甲基化水平在SCZ 患者中显著升高，并且男性和女性患者的MAOA 甲基化水平与精神分裂症呈现正相关。

4.1.1 COMT 基因COMT基因位于22q11.2 染色体的片段中，敲除该基因会导致复杂的综合征，其精神表现包括SCZ 以及其他的精神障碍。COMT基因编码2 种特征显著的蛋白质亚型，细胞质中可溶性的COMT（Soluble cytoplasmic COMT，S-COMT）以及膜结合形式的COMT（membranebound COMT，MB-COMT）。MB-COMT 对多巴胺和去甲肾上腺素的亲和力大约是S-COMT 的10 倍，这表明MB-COMT 更适合在大脑的生理水平上代谢包括多巴胺在内的儿茶酚胺。在SCZ 中，COMT 酶参与多巴胺等儿茶酚胺的降解过程。有证据表明，在SCZ 患者中，COMT启动子区域甲基化增加，并且可以作为男性SCZ 患者外周生物标志物用于预测男性的SCZ 风险[24]。此外，SCZ的潜在风险被认为与COMT基因的甲基化程度降低有关[24-26]，COMT甲基化增加被认为会导致COMT基因表达降低[27]。人们认为，SCZ 患者的COMT 甲基化程度降低导致COMT 蛋白的表达增加，从而使其活性增加。COMT 活性增加后导致神经递质释放后突触DA 水平下降，这最终降低了突触后神经元的多巴胺能刺激，当这种情况发生在前额区时，可能导致SCZ 患者出现常见的执行功能下降。

4.1.2 GAD1 基因谷氨酸脱羧酶1 基因（GAD1）编码编码谷氨酸脱羧酶，在人体中该酶负责催化L-谷氨酸产生γ-氨基丁酸。GABA 是一种主要的抑制性神经元递质，其抑制作用由GABAA 和GABAB 两种受体介导，在神经发育障碍中起关键作用，与癫痫、精神分裂症、双相情感障碍等多种神经精神疾病有关[28]。国内有研究发现，SCZ患者启动子DNA 甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC）比值与单核苷酸多态性（SNPs）基因型显著相关，揭示了SCZ 患者GABRB2 基因型依赖性甲基化和羟甲基化的改变[29-30]。此外，GAD1基因启动子高甲基化与SCZ 患者基因型和蛋白表达不足有关，前扣带回皮质的脂肪酸结合蛋白3（Fatty acid-binding proteins，FABP3）调节谷氨酸脱羧酶（GAD1）启动子区的甲基化状态[31]。有研究表明，GABA 能基因如GAD1的下调是通过额叶皮层和其他脑区的高甲基化介导的，且这种高甲基化发生在基因的启动子区域[32]。GAD1基因的表达改变被认为会导致工作记忆功能受损和皮质活动紊乱，这在SCZ 患者中很明显[33]。以上证据表明SCZ 患者存在GAD1基因的启动子区域甲基化失调。

4.2 BDNF 基因

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一种调节突触传递和可塑性的神经营养因子，在神经元细胞的增殖、分化、成熟和存活中发挥作用。在大脑中，BDNF 是脑区神经可塑性的关键中介，与早期生活事件和精神疾病都有关联。有研究认为BDNF基因甲基化变化可能是早期生活逆境的一个生物标志物，因此也可能是成人精神疾病的一个生物标志物[34]。在SCZ 中，BDNF基因被认为是SCZ 发病机制的候选基因，与SCZ 的认知症状有关[35]，BDNF启动子的CpG 位点DNA 甲基化与SCZ 认知功能修复有关[36]。此外，有研究表明，BDNF基因rs6265 甲基化与基因型相互作用，与SCZ 相关[37]。此前也有研究发现，SCZ 患者前额叶皮层和纹状体BDNF 基因的DNA 甲基化状态没有改变[38]。导致研究结果不一致，可能是由于影响DNA 甲基化的共同因素所导致，如发病年龄、性别和药物滥用等[36]。

4.3 RELN 基因

RELN基因被认为与SCZ 有关[39-41]。RELN基因编码一种细胞外基质蛋白，该蛋白在大脑发育过程中参与细胞定位和神经元迁移[42]。RELN基因的甲基化被认为是调节RELN表达的重要因素，被认为与精神疾病有关。SCZ 相关的药物以及动物模型也能证实DNA 甲基转移酶I（DNMT1）导致谷氨酸脱羧酶67（GAD67）、细胞外基质蛋白（RELN）和脑源性神经营养因子（BDNF）等基因高甲基化，导致基因表达减少，并观察到类似的行为内表型[43-44]。此外，还发现SCZ 患者大脑中RELN基因表达减少还可能是SCZ 患者认知功能异常的基础[45]，通过认知修复也可以可逆性的改变RELN启动子CpG 甲基化水平，从而改变额叶以及额叶与颞叶的功能连接[36]。近期的研究还发现SCZ 的不同阶段，患者RELN基因的DNA 甲基水平不同，首次发作的SCZ 和慢性SCZ 的队列研究中RELN 启动子区域DNA 甲基化水平可能作为症状严重程度的生物标记物基因之一[46]。

4.4 其他基因

此外，还可有研究发现胆碱能受体烟碱性α7 基因（CHRNA7）参与SCZ 患者的认知内表型，有研究认为其启动子甲基化会导致SCZ 患者中该基因表达降低[47]。Misiak 等[48]发现糖皮质激素受体基因（NR3C1）在首发SCZ 患者中甲基化水平显著降低，SCZ 家族性高危人群中甲基化水平升高，且NR3C1基因的高甲基化水平与认知功能障碍有关。Liu L 等[49]发现，盐皮质激素受体基因（NR3C2）DNA 甲基化与SCZ 的性别依赖有关，且具有性别特异性效应。此外Liu L 等[50]对SCZ 患者可溶性载体家族6-4 号基因（SLC6A4）的研究也发现SLC6A4的甲基化水平在女性明显高于男性。SCZ 组SLC6A4甲基化水平与SCZ 显著相关。以上这些研究结果表明多个基因DNA 甲基化与SCZ 密切相关。

5 小结

在SCZ 患者的DNA 甲基化研究中，发现诸如MAOA、COMT、GAD1、BDNF、RELN等诸多基因的DNA 甲基化与SCZ 有关。然而，受环境等诸多因素的影响，研究结果的一致性和可重复性仍较有限，需要对吸烟、饮酒、病程、用药、年龄等诸多环境因素进行控制。目前的研究也已经注意到这些局限性，可以使用SCZ 的动物模型来对上述局限性因素加以控制，开展新的动物模型验证实验。此外，要清楚地了解DNA 甲基化对SCZ 的影响，需要进一步了解SCZ 患者不同检材中DNA 的甲基化差异。同时，也需要更进一步了解不同基因的甲基化在SCZ 患者中对基因表达调控的影响。展望进一步的研究，在分子水平以及细胞水平开展更多的功能验证实验以及细胞验证试验，同样也是研究DNA 甲基化与SCZ 的重要环节。