云南省结核分枝杆菌分子特征和传播相关因素分析

陈连勇，杨 星，茹浩浩，陈 涛，闫双群，许 琳

（云南省疾病预防控制中心结核病防治所，云南 昆明 650022）

结核病是由结核分枝杆菌引起的的一种古老的慢性传染性疾病，WHO 2021 年报告显示[1]2020 年全球新发结核病患者990 万例，结核病是导致死亡的主要原因之一，严重危害了群众身体健康和经济社会的发展。随着科学技术的发展，分子生物学技术在结核病的诊断、流行病学调查方面显示了独特作用。通过对结核分枝杆菌的传播动力学、来源和传播的深入了解，增强了笔者对结核流行病学的理解，有助于有效预防和控制结核病。本研究采用Spoligotyping 和MIRU-VNTR技术，对来源于云南省耐药监测点的结核分枝杆菌开展基因分型，以了解云南省MTB 的分子特征、传播及相关影响因素。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

846 株结核分枝杆菌为2016 年1 月至2019年12 月期间，云南省32 个耐药监测点从就诊中发现的涂阳肺结核病患者，收集其痰标本并分离培养后获得。同时以国家结核病参比实验室提供的结核杆菌标准株（H37Rv）作为对照。

1.2 表型药物敏感性试验

采用比例法，具体试验操作参照人卫版《结核病实验室检验规程》[2]，药敏试验的6 种抗结核药物分别为异烟肼（INH）、链霉素（SM）、利福平（RFP）、卡那霉素（KM）、氧氟沙星（OFX）和乙胺丁醇（EMB），培养基中药物终浓度分别为0.2 μg/mL、4 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、2 μg/mL和2 μg/mL。同时以H37Rv 作为药敏试验的对照进行质量控制。

1.3 DNA 模板制备

用标准接种环均匀刮取1 环改良罗氏培养基斜面上生长良好的新鲜菌株，重悬于300 μL TE 中，95℃恒温金属浴20 min 灭活，然后使用Lab-Aid 824 结核分枝杆菌核酸提取Maxi 试剂盒及Lab-Aid 824 核酸提取仪，根据操作说明提取DNA 作为模板备用。

1.4 Spoligotyping 分型

采用荧光PCR 熔解曲线技术（McSpoligotyping）进行Spoligotyping 基因分型，每个样本分为3 个反应体系（A/B/C），每个PCR 反应体系为25 μL，分别含McSpoligotyping PCR Mix 19.75 μL（A/B/C），McSpoligotyping 酶混合液0.25 μL，DNA 模板5 μL。PCR 反应分为两个程序，（1）扩增程序：50℃5 min→95℃ 10 min→（95℃ 15s→57℃ 15s→72℃15s）×50 个循环；（2）熔解程序：95℃ 1 min→35℃ 1 min→35℃～90℃ 以 0.04℃/s升温速率的速度进行熔解分析，且在此阶段采集FAM、CY5、ROX 和HEX 通道荧光信号。判读结果按顺序录入到Excel 表中。将Spoligotyping 结果按要求格式在线导入SITVITWEB 数据库中（http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE）进行比对，获得Spoligotyping 分型结果等信息。

1.5 MIRU-VNTR 分型

采用国际通用的15 个MIRU-VNTR 位点进行结核分枝杆菌基因分型，15 个位点分别是：Mtub04、ETR-C、MIRU4、MIRU40、MIRU10、MIRU16、Mtub21、QUB-11b、ETR-A、Mtub30、MIRU26、MIRU31、Mtub39、QUB-26、和QUB-4156。每个PCR 反应体系的体积为20 μL，分别含19 μL PCR Mix，1 μL DNA 模板。PCR 反应条件为：95℃ 10 min→（94℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃1 min）×35 个循环→72℃ 7 min。

取1.5 μL 扩增产物，在含1.2%浓度的琼脂糖凝胶上电泳。电压85 V，120-160 分钟，然后在凝胶成像系统下成像，根据迁移度判定扩增目的片段的的相对分子量，确定各样本各VNTR 位点重复单元的重复数并录入到Excel 表格中。并以H37Rv 作为对照。

利用BioNumberics 5.0 软件对Spoligotyping和MIRU-VNTR 的数字化试验结果开展基因分型聚类分析。具有完全相同基因型的菌株≥2 个即为成簇，用于估算近期传播指数的成簇率采用RTIn-1 法[3]，即成簇率=（nc-c）/n，n 代表所有的结核分枝杆菌菌株数，c 代表结核分枝杆菌菌株成簇数，nc指所有成簇的菌株数。

1.6 统计学处理

采用SPSS16.0 软件进行统计分析。计数资料采用百分率（%）表示，率的比较采用χ2检验，成簇危险因素分析是将是否成簇作为因变量，将单因素分析中P＜ 0.2 的变量纳入Logistic 回归分析，计算比值比（OR）和95%可信区间（95%CI），P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本情况

846 例病例中，来自云南省16 州（市）的32个耐药监测县（区），16 个州（市）病例数最少的为21 例，最多的为125 例（表1）；男女比例为2.78:1；平均年龄（43.41±16.59）岁（最小年龄12 岁，最大年龄85 岁）；民族分布以汉族为主（513，60.64%），其次分别为彝族（104，12.29%）和傈僳族（44，5.20%）；小学及以下文化程度的患者的比例占57.80%；农民患者占90.07%。初治肺结核患者占到总数的88.53%（749/846）。

表1 846 株结核分枝杆菌的州市分布情况Tab.1 Distributions of 846 Mycobacterium tuberculosis by prefecture

2.2 药敏试验结果

846 株结核分枝杆菌中，总耐药率为20.80%。对INH、SM、RFP、KM、OFX、EMB 6 种抗结核药物的耐药率依次为10.28%、9.10%、6.38%、2.48%、2.25%和1.65%，其中耐多药（MDR）菌株有32 株，MDR 率为3.78%。

2.3 Spoligotyping 分型结果

846 株结核分枝杆菌菌株中，北京基因型有539 株，占菌株总数的63.71%，为最大的一个基因家族。非北京基因型有307 株，占菌株数的36.29%，非北京基因型主要基因家族包括T1（20.69%，175/846）、T3（4.49%，38/846）和T2（2.36%，20/846），其次还有H3（0.83%，7/846）、T2-T3（0.59%，5/846）、T5（0.47%，4/846）、MANU2（0.47%，4/846）、EAI3-IND（0.12%，1/846）和CAS1_DELHI（0.12%，1/846）等基因家族（表2）。另有42 株（4.96%）在SITVITWEB 数据库中不存在，为本研究中新发现或未定义的Spoligotyping分型结果。

表2 846 株结核分枝杆菌Spoligotyping 分型结果Tab.2 Spoligotype of 846 Mycobacterium tuberculosis Strains

各州（市）北京基因型所占比例范围为43.55%～82.61%，其中，迪庆州的北京基因型占比最高，达82.61%（19/23），其次为曲靖市（78.22%）和楚雄州（76.25%）；北京基因型占比最低的为西双版纳州，为47.06%（24/51），各州市北京基因型分布存在明显的地域分布差异（χ2=159.40，P＜ 0.001）。北京基因型和非北京基因型结核分枝杆菌与耐药无关（P＜ 0.05）

2.4 MIRU-VNTR 结果

846 株结核分枝杆菌由2 个基因群组成，共627 个基因型，包括101 个基因簇和526 个独立基因型（图1），101 个基因簇中，成簇菌株数为2～18 株，成簇率为25.89%。根据与Spoligotyping结果比对，第Ⅰ群均为北京基因型，539 株含379 个基因型，包括71 个基因簇和308 个独立基因型，成簇率为29.68%。第Ⅱ群共307 株菌，为非北京基因型，占总菌株数的36.29%，含248个基因型共307 株，其中218 个独立基因型，其余89 株成簇的菌株分为30 个基因簇，成簇率为19.22%。Ⅰ群与Ⅱ群菌株成簇率相比，差异有统计学意义（29.68 % vs 19.22%，P＜ 0.01）。

图1 846 株结核分枝杆菌的15 MIRU-VNTR 位点聚类分析图Fig.1 Dendrogram of 15 MIRU-VNTR loci in 846 strains of Mycobacterium tuberculosis

2.5 结核近期传播危险因素分析

以结核分枝杆菌是否成簇当作因变量，将结核病患者性别、年龄、民族、来源、耐药情况、治疗史和基因型等因素纳入单因素分析（表3），然后以P＜ 0.2 作为纳入标准进行Logistic 多元回归分析，结果显示，北京基因型及INH 敏感是结核分枝杆菌成簇的危险因素，与非北京基因型相比，北京基因型成簇的风险是其1.861 倍（P＜ 0.05，95%CI1.376～2.516）；而INH 敏感菌株成簇风险是耐药菌株的1.869 倍（P＜ 0.05，95%CI1.129～3.094），见表4。

表3 结核分枝杆菌成簇影响的单因素分析Tab.3 Univariate Analysis of Clustering of Mycobacterium Tuberculosis

表4 结核分枝杆菌成簇影响的多因素分析Tab.4 Multifactorial Analysis of Clustering of Mycobacterium Tuberculosis

3 讨论

本研究对来自云南省的846 株结核分枝杆菌应用Spoligotyping 和15 个MIRU-VNTR 位点的基因分型方法进行了分子流行病学特征分析，结果显示，我省结核分枝杆菌北京基因型的比例为63.71%，是我省结核分枝杆菌的主要流行株，结核分枝杆菌北京基因型比例略高于既往研究结果（55.7%）[4]，与62.2%的全国平均水平及周边省份如四川（55.7%）、广西（60.48%）、贵州（55.13%）相近[5-7]，远远低于江西（78.2%）、江苏（81.1%）等东部省份[8-9]及甘肃（87.58%）、北京（83.3%）、河南（89.8%）等北部省份[10-12]，同时，我省各州、市来源菌株北京基因型比例差异较大（43.55%～82.61%），表明我省结核分枝杆菌北京基因型分布受地域影响较大。本研究还对基因型与耐药的相关性进行了分析，结果显示北京基因型与结核分枝杆菌对各药物的耐药性以及MDR 均无相关性，这与Luo D 等[8,13-14]研究结果一致，也有研究表明北京基因型结核分枝杆菌与耐药特别是耐多药相关[5,15-17]，这些差异的产生可能是由于地理、社会经济条件、HIV 或糖尿病等因素引起的[10]。

非北京基因型中，以T 家族为主（T1、T3 和T2 等），其次为MANU、H、LAM 和X 等基因型、这与全国其他地方的分布类似，但本研究中还发现了CAS1_DELHI 和EAI3-IND 等基因型以及43株（5.08%）的未定义或新的Spoligotyping 基因型。EAI 是东南亚和南亚最常见的家族，也流行于北欧，并可能与输入病例相关，在缅甸，EAI 基因型比例仅次于北京基因型[18]，而在国内仅见广西有报道[7]；CAS 主要存在于南亚、西亚及非洲东部地区[19]，我国少见，绝大部分分布于北方地区[5]。而CAS1_DELHI 和EAI3-IND 等我省既往未见报道，本次研究发现的这些基因型这些菌株均来源于边境州、市，这可能与我省地处西南边陲，与缅甸、越南和老挝接壤，且与境外无天然屏障，边贸及人员交流频繁，结核分枝杆菌基因型也表现为高度多态性。

本研究使用15 个MIRU-VNTR 位点对云南省的结核分枝杆菌基因分型，成簇率为25.89%，说明在云南省存在结核分枝杆菌的近期传播，因此必须采取措施主动发现患者并实行切实有效的治疗管理措施，控制结核病的近期传播，并对结核病患者的密切接触者进行筛查，而云南省近些年也加大了经费投资力度，推广使用新诊断技术、建立示范区等措施，提高患者的发现和治疗管理，这将有效地发现肺结核患者并控制结核病的近期传播。本研究对结核分枝杆菌成簇相关影响因素分析结果显示北京基因型及对INH 敏感结核分枝杆菌更容易成簇，这与既往研究一致[8,11,13,17,20]，这可能与北京基因型具有高毒力以及卡介苗接种等因素有关，本研究中北京基因型结核分枝杆菌成簇率显著高于非北京基因型，这也说明了北京基因型具有更强的毒力和传播能力。有研究表明耐药结核病病人比敏感病例更容易成簇[15,17,20]，认为耐药性导致治疗失败并导致患者长期保持感染性，因而更容易成簇，而在本研究中，异烟肼耐药菌株比异烟肼敏感菌株更不容易成簇，这与Durmaz 等[21-22]研究结果一致，有动物模型显示异烟肼耐药可能导致结核分枝杆菌的毒力下降[22]，推测异烟肼耐药菌株在人群中产生继发病例的可能性下降，也有研究表明，成簇和不成簇的异烟肼耐药菌株在异烟肼耐药基因-katG 基因中的特定突变位点的发生率不同，传播能力存在差异[22]，具体原因还有待今后的进一步研究。

综上所述，云南省结核分枝杆菌基因型呈高度多态性，但北京基因型仍是主要流行株，云南省存在结核病的近期传播，北京基因型和INH 敏感是近期传播的影响因素，因此必须采取各种措施主动发现传染源、规范治疗和管理，使其不再具有传染性，并及时筛查活动性结核病例的密切接触者，以控制结核的传播。