新疆维吾尔自治区动物莱姆病的流行病学调查

叶锋，杜秋丽，刘丽娅，马晓菁，谢彩云，谷文喜，马俊杰，易新萍

1.新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，新疆乌鲁木齐830011；2.济宁学院生命科学与生物工程学院，山东曲阜273155

莱姆病是一种由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）感染引起的人兽共患传染病，主要经蜱虫叮咬进行传播，可造成人皮肤、神经、关节等多器官损伤。莱姆病在欧洲、亚洲及北美洲的温带地区均有流行，其宿主涉及多种野生及家养动物［1］。艾承绪等［2］于1986 年在中国黑龙江省海林县林区发现并分离出3 株伯氏疏螺旋体。随后研究表明，我国30个省区均有莱姆病病例，多出现于山林地区［3］。

5S-23S rRNA 基因间隔区是伯氏疏螺旋体的保守片段，广泛应用于伯氏疏螺旋体的鉴定及分型研究［4］。目前，全球已发现的伯氏疏螺旋体基因型已超过10 个［5-6］，我国主要以B.garinii型为主［7］。新疆维吾尔自治区（简称新疆）是莱姆病自然疫源地，研究显示，在新疆南北疆地区的多数人群中检测出莱姆病抗体［8-9］，在鼠和犬血液样本中也检测出伯氏疏螺旋体DNA 及抗体［10-11］，但目前关于其他饲养动物的莱姆病感染情况的研究较少。因此，本研究对新疆4 个地区5 种蜱虫宿主动物的莱姆病流行情况进行血清学调查，以期为新疆地区莱姆病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1血清 由新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉及喀什4个地区33 个采样点采集相应地区的牛、绵羊、山羊、马和犬血清样本共814 份，其中牛、绵羊、山羊、马血清各182份，犬血清86份，见表1。

表1 动物血清样本数量统计表Tab.1 Counts of animal serum samples

1.2菌株及虫株 伯氏疏螺旋体（ATCC35210）标准株B31 和钩端螺旋体标准株（DSM21537）由新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心保存；于新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉及喀什4个地区共收集蜱虫135只。

1.3主要试剂 血清莱姆病IgG抗体检测试剂盒购自美国Trust Specialty Zeal公司；DL2000 DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和微量DNA 提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4血清样本中莱姆病IgG 抗体水平的检测 取5种动物血清样本，按照莱姆病抗体IgG血清检测试剂盒说明书进行检测。

1.5蜱虫体内伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区序列的扩增 采用微量DNA 提取试剂盒和细菌基因组DNA 提取试剂盒提取蜱虫、伯氏疏螺旋体标准株B31（阳性对照）和钩端螺旋体标准株（阴性对照）DNA，以其为模板，按文献［12］的巢式PCR 法扩增伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA 基因间隔区序列。获得的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，取阳性蜱虫DNA样本送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6系统进化树的构建 将1.5项伯氏疏螺旋体阳性样本的PCR 产物测序结果与GenBank 中已登录的伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区序列（登录号为：JX888456.1、MK333420.1、AY032903.1、GU723-464.1、DQ102456.1、AY032913.1、AB178337.1、Z7-7173.1、AY032917.1）进行BLAST 比对，计算核苷酸序列同源性。应用MEGA X 软件，将阳性样本测序结果与上述GenBank 中已公开发表的9 条序列采用NJ 算法（bootstrap为1 000）构建系统进化树。

1.7统计学分析 应用SPSS 25.0统计学软件进行统计分析，莱姆病IgG 抗体阳性率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清样本中莱姆病IgG抗体水平

2.1.14 个地区间的比较 4 个地区中，乌鲁木齐地区的莱姆病IgG抗体阳性率最高，达23.6%（66／280），95%置信区间为16.5% ~ 30.7%；其次为伊犁和喀什地区，抗体阳性率分别为2.7%（10／370）和2.4%（2／84），95%置信区间分别为0.3% ~ 5.1%和0 ~7.2%；昌吉地区的莱姆病IgG 抗体阳性率为0。4个地区间差异有统计学意义（χ2=48.481，P<0.001）。

2.1.25 种动物间的比较 在5 种动物中，犬血清的莱姆病IgG抗体阳性率最高，达60.5%（52／86），95%置信区间为45.2%~75.7%；其次依次为山羊血清、绵羊血清和牛血清，抗体阳性率分别为18.7%（34／182）、4.4%（8／182）和1.1%（2／182），95%置信区间分别为10.5%~26.8%、0.1%~8.7%和0~3.3%；马血清中未检测出莱姆病IgG 抗体。5 种宿主动物间差异有统计学意义（χ2=129.03，P<0.001）。

2.2蜱虫体内5S-23S rRNA 基因间隔区序列的扩增135 份蜱虫DNA 样本的巢式PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，其中24份DNA样本于230 bp处可见5S-23S rRNA 基因间隔区序列条带，大小与预期相符，编号为2019-1、2019-2、2019-4、2019-5、2019-6、2019-7、2019-9、2019-10、2019-11、2019-12、2019-13、2019-14、2020-2、2020-3、2020-4、2020-5、2020-7、2020-8、2020-9、2020-10、2020-11、2020-12、2020-14、2020-15，部分结果见图1。新疆地区蜱虫的伯氏疏螺旋体带菌率为17.78%。

图1 蜱虫DNA样本的巢式PCR鉴定Fig.1 Identification of tick DNA samples by nested PCR

2.3系统进化树分析 24份阳性蜱虫DNA样本中，11份（2019-2、2019-4、2019-6、2019-7、2019-10、2019-12、2019-14、2020-3、2020-9、2020-10、2020-12）与B.garinii分离株序列同源性大于99%，占比75%；9份（2019-1、2019-5、2019-11、2019-13、2020-4、2020-7、2020-8、2020-14、2020-15）与B.burgdorferi分离株序列同源性大于99%，占比8.33%；4份（2019-9、2020-2、2020-5、2020-11）与B.afzelii型分离株序列同源性大于99%，占比16.67%。24 份阳性蜱虫DNA 样本的扩增序列分为2 大分支，其中3 份与B.garinii基因型菌株YN28 和NMK6 为同一支，19 份样本与B.garinii基因型菌株MGDS为同一支，且这19份样本又可分为3个进化较为接近的分支；2 份样本与B.burgdorferi基因型菌株N40、WX337及B31为同一支。见图2。

图2 5S-23S rRNA基因间隔区序列的系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree based on 5S-23S rRNA gene spacer sequence

3 讨论

目前，我国临床中常采用间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay，IFA）和ELISA法进行莱姆病初步筛查，再通过Western blot 进行确诊［13-15］。本实验采用ELISA 法对在新疆4 个地区33 个采样点采集的814份血清样本进行了检测，结果表明，其中3个地区均存在莱姆病感染的情况，这与武军元等［9］的流行病学调查结果一致。5 种动物中，4 种动物血清含有莱姆病抗体，其中犬血清的抗体阳性率最高，达60.5%，其原因可能是流浪犬在日常环境中接触蜱虫的机会较大，本研究中犬血清均采集自乌鲁木齐地区，因此导致该地区的莱姆病IgG抗体整体阳性率较高（达23.6%）。本实验中182 份山羊血清均采集自乌鲁木齐和伊犁地区，其抗体阳性率达18.7%，这可能与山羊喜爱在山林间活动的生活习性及山羊毛较长易于蜱虫附着叮咬有关。采集的182 份马血清来自于伊犁地区2 个不同的马场，并未发现莱姆病感染，可能是与马匹在集中饲养环境中不易接触到蜱虫有关。另外，本实验中检测的动物莱姆病IgG抗体阳性，并不代表该动物体内一定存在伯氏疏螺旋体病原，仅表明该动物曾经感染或正在感染莱姆病。

本研究对135 份蜱虫DNA 样本进行了5S-23S rRNA 基因间隔区序列的巢式PCR 扩增，有24 份样本为阳性，新疆地区蜱虫的伯氏疏螺旋体带菌率为17.78%。系统进化分析比对结果显示，蜱虫中的伯氏疏螺旋体优势基因型主要为B.garinii型，该结论也与文献［16-17］的研究结果一致。与B.garinii基因型菌株MGDS 为同一支的19 份蜱虫DNA 阳性样本中，4 份样本（2019-9、2020-2、2020-5、2020-11）序列与B.afzelii型同源性较高，7份样本（2019-11、2019-13、2020-4、2020-7、2020-8、2020-14、2020-15）与B.burgdorferi型同源性较高，且与另外8份B.garinii样本具有较近的进化关系，表明这19 份样本可能由同一祖先分化而来［18］。上述结果表明，新疆地区主要流行的伯氏疏螺旋体为B.afzelii、B.garinii和B.burgdorferi型，以上基因型主要引起神经损伤和慢性皮肤病变，提示当地有相应症状的人员应将莱姆病列入排查范围。

本研究结果仅限于样本的采集地，数据不能精准反映各地区动物间的莱姆病流行情况，仅在一定程度上表明了新疆地区动物莱姆病的整体流行情况，并判定流行毒株。本研究结果也提示，在上述地区工作的林区工人、农民及放牧人员应提高个人防护意识，做好动物体外驱虫工作，减少皮肤暴露，预防经蜱虫叮咬感染莱姆病。