灵芝提取物改善斑马鱼睡眠的作用机制研究

何荣军,贺 丹,张安强,孙培龙

(浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州 310014)

失眠在现代社会尤为普遍[1],严重失眠还会增加高血压、心血管疾病的死亡率及失眠患者的患癌风险[2]。中医常用灵芝缓解病患的失眠症状[3]。近年来研究发现灵芝水提物可通过增加小鼠脑内GABA、5-HT和TNF-α的含量来发挥镇静催眠作用[4-6]。在睡眠机制的研究上,证实睡眠肽、GABA、5-HT、褪黑素、谷氨酸和组胺等物质能够影响睡眠和觉醒[7]。而在失眠靶点的研究中,γ-氨基丁酸A(GABAA)[8]受体、褪黑素(MT)[9]受体、5-HT[10]受体和谷氨酸[11]受体的相关靶点不断受到关注。斑马鱼是睡眠研究的新型生物,其基因及蛋白与人类相似度较高[12],除此之外还具有适应性强、繁殖周期短和繁殖能力强等特点[13]。斑马鱼在睡眠研究中具有较多优势:1) 与人类一样,斑马鱼具有正常的睡眠周期;2) 斑马鱼在睡眠被剥夺后会增加睡眠时间[14];3) 兴奋类药物能够使斑马鱼快速失眠[15]。Wang等[16]以斑马鱼为实验动物,成功证实了五味子乙醇提取物和五味子苷对斑马鱼失眠的改善作用。

灵芝的化学成分复杂,而使用不同溶剂提取灵芝,得到的化学成分不同,难以对灵芝不同提取物改善睡眠的功效进行快速而科学的评价。因此,笔者采用咖啡因诱导斑马鱼造成失眠模型,给予灵芝提取物和奥沙西泮治疗,考察灵芝提取物对失眠症斑马鱼睡眠的改善作用。为了研究灵芝提取物中改善睡眠的化学成分,对两种灵芝提取物进行萃取分离,筛选出灵芝萃取分离物中的有效助眠成分。笔者从灵芝提取物对GABRA1,GABRA3,GABRA5,GAD1,GRIN2A,HTR1A,HTR2A和MTNR1AmRNA相对表达水平的影响来探讨其改善睡眠的生物靶点及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤芝子实体由浙江方格药业有限公司赠送;95%乙醇、石油醚(沸程60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇等购自国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯;二甲基亚砜(DMSO)、亚甲基蓝、异丙醇、二水氯化钙、氯化钾、氯化钠、咖啡因、无水硫酸镁购自阿拉丁生物科技有限公司;奥沙西泮购自北京益民药业有限公司。

ChamQ Universal SYBY qPCR Master Mix试剂、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂、DEPC水、Trizol试剂均购自诺唯赞有限公司;96孔板、6孔板购自无锡耐思生命科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

AL-104电子天平,Mettler Toledo有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台,上海博讯实业有限公司;Video track 3行为分析仪,法国View Point Life Sciences有限公司;YXQ-LS-50S11立式压力蒸气灭菌器,上海博讯实业有限公司;ALPHA 2-4 LD冷冻干燥机,德国Christ公司;CR21N高速台式离心机,日本日立株式会社;HWS-150恒温恒湿培养箱,上海森信实验仪器有限公司;Nano Drop lite核酸蛋白分析仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;7300plus荧光定量PCR仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 样品制备

1.3.1 灵芝水提取物的制备

称取100 g灵芝子实体,按照(1∶15) g/mL的料液比加入水,煎煮2 h,重复3次,合并上清液,用旋转蒸发仪在50 ℃下去除水分得到水提物浸膏,冷冻干燥得到灵芝水提物粉末。

1.3.2 灵芝乙醇提取物的制备

用超微粉碎机将灵芝子实体粉碎,并过120目筛,称取100 g粉碎后的粉末,按照一定的料液比加入85%的乙醇溶液,浸泡过夜,抽滤后收集滤液,重复3次,合并上清液,用旋转蒸发仪在45 ℃下除去溶剂得到乙醇提取物浸膏,加入去离子水,继续旋蒸,除去残留乙醇,冷冻干燥得到乙醇提取物粉末。

1.3.3 灵芝水提物的分离

灵芝水提物粉末以(1∶15) g/mL的料液比加入去离子水,首先使灵芝水提物粉末充分溶解于水中,然后加入一定量的95%乙醇,最终乙醇体积分数为85%。分别收集上清液和沉淀,用旋转蒸发器脱除各相浸膏中的乙醇,再进行冷冻干燥得到灵芝低分子量成分和粗多糖。

1.3.4 灵芝乙醇提取物的分离

将上述步骤得到的灵芝乙醇提取物干粉以(1∶10) g/mL的料液比加入去离子水,使干粉均匀地分散在去离子水中形成悬浊液,随后分别加入3倍体积的石油醚和乙酸乙酯、1倍体积的正丁醇进行萃取,静置过夜,重复3次,收集并合并上清液,最终得到水相、石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相4个提取相。用旋转蒸发器脱除每一相提取物的溶剂,再冷冻干燥得到各个相的提取物干粉。

1.3.5 灵芝粗多糖中多糖和蛋白含量的测定

参考Cui等[5]的实验方法,使用苯酚硫酸法测定灵芝粗多糖。通过BCA蛋白试剂盒测定灵芝粗多糖的蛋白含量[17]。

1.3.6 灵芝乙酸乙酯相提取物总三萜含量的测定

参考邹桂欣等[18]的实验方法,总三萜酸含量采用香草醛冰醋酸-高氯酸显色法测定。

1.4 斑马鱼饲养方法

6个月AB型野生系斑马鱼购于上海费曦生物有限公司。斑马鱼的养殖温度为28 ℃,使用自动计时器设置光照和黑暗交替循环,光暗条件为14 h光照(08:00—22:00),10 h黑暗(22:00—第2天08:00)。10条斑马鱼雄鱼和10条斑马鱼雌鱼分别放入两个7 L的鱼缸中喂养,pH保持在7.2,盐度保持在500 plus/cm,每隔36 h换一次水,每天早中晚定时喂养丰年虾2次。将雌、雄鱼按照1∶1的比例放入产卵专用缸,第2天早晨雌雄鱼开始追逐,2 h后收集鱼卵,将鱼卵放入烧杯或者其他容器中,去除死卵和杂物等,成年的雌鱼、雄鱼转移回原来的鱼缸中,并及时投喂鱼食,更换水。斑马鱼每两周交配一次。

斑马鱼的鱼卵放入稀释60倍的E3培养液中,在28.5 ℃条件下的恒温培养箱中模拟昼夜交替培养。每天观察2次,检查胚胎发育状况,若出现发白的死卵,及时清除,幼鱼的养殖水每天更换2～3次,保持水质干净。鱼卵培养孵化5 d后开始准备实验。

1.5 实验方法

1.5.1 确定药物的最大耐受质量浓度(MTC)

根据夏婧等[19]的方法并稍加修改。选取5 d野生型AB系斑马鱼,在显微镜下挑选发育正常的斑马鱼,对不同质量浓度的各种灵芝提取物进行实验,观察统计5 d幼鱼的存活情况,确定各种灵芝提取物的最大耐受质量浓度。分别以各种灵芝提取物最大耐受质量浓度的1/9,1/3,1倍设置为各种灵芝提取物的低剂量、中剂量和高剂量。根据预实验确定咖啡因作为失眠模型造模药物,给药浓度为200 μmol/L。在设定质量浓度梯度实验中,显示0.025 g/L为最低有效质量浓度,故选用0.025 g/L作为奥沙西泮组的给药质量浓度。

1.5.2 斑马鱼失眠模型的建立

参考何东方等[20]建立的斑马鱼失眠模型方法。分组:每组22孔,依次分为空白对照组、咖啡因组、奥沙西泮组、低中高质量浓度灵芝治疗组。灵芝治疗组1分为灵芝水提物、灵芝粗多糖和灵芝低分子量成分;灵芝治疗组2分为灵芝乙醇提取物、灵芝石油醚相提取物、灵芝乙酸乙酯相提取物、灵芝正丁醇相提取物和灵芝水相提取物。

1.5.3 评价药物对失眠症斑马鱼睡眠的改善作用

行为参数根据文献[21-23]方法并稍加修改,观察时间为1 h。斑马鱼的数据15 s采集一次,这些原始数据也代表着幼鱼的睡眠和运动时间。行为轨迹仪的设定程序如下:速度小于0.5 cm/s被认定为是慢速运动,速度0.5～2.0 cm/s被认定为是中速运动,速度大于2 cm/s被认定为是快速运动;助眠筛选分析基于总活动量、睡眠总时间、觉醒活动量以及睡眠回合次数等睡眠/觉醒行为参数;如果每15 s幼鱼为慢速运动,运动时间不超过0.1 s,则定为睡眠[24]。一个睡眠回合指的是发生一次的睡眠序列。具体定义如下:

1) 睡眠总时间(Rest total):1 h内平均睡眠时间的总和。

2) 总的活动量(Activity total):1 h内运动和睡眠时间的总和。

3) 觉醒活动量(Waking activity):1 h内平均运动量的总和。

4) 睡眠回合次数(Rest bouts):1 h内发生多少睡眠次数。

1.5.4 灵芝粗多糖和灵芝乙酸乙酯相提取物对GABAA和5-HT相关受体mRNA相对表达水平的影响

各取30 条经0.600 g/L灵芝粗多糖、0.125 g/L灵芝乙酸乙酯相提取物、0.025 g/L奥沙西泮和200 μmol/L咖啡因处理24 h后的斑马鱼,用Trizol试剂提取总RNA,扩增生成cDNA。PCR反应条件:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环,分别测定GABRA1,GABRA3,GABRA5,GAD1,GRIN2A,HTR1A,HTR2A,MTNR1A及β-Actin的吸光值。以β-Actin作为内参基因。基因序列如表1所示。

表1 基因序列表

采用Ct对比目的基因表达水平。选用β-Actin作为内参基因进行参照,将目的基因的Ct减去内参基因的Ct得到目的基因mRNA的相对表达量,记为2-▲Ct。相较于空白对照组,给药组目的基因的表达变化倍数为2-▲▲Ct,其中,▲▲Ct=(目的基因的Ct-内参基因的Ct)给药组-(目的基因的Ct-内参基因的Ct)空白对照组。

1.5.5 统计学方法

每个测试组22条鱼,每个样品质量浓度独立进行3次实验,取平均值。计算标准误差,显著性设定在P<0.05(*),使用单因素方差分析处理数据,显著性分析通过SPSS 20.0完成。

2 结果与分析

2.1 药物的最大耐受质量浓度(MTC)

经测定提取的灵芝粗多糖的多糖质量分数为86.7%,蛋白质质量分数为3.8%,提取的灵芝乙酸乙酯的总三萜质量分数为32.6%。用不同质量浓度的药物和灵芝处理斑马鱼24 h,斑马鱼致死率见图1。奥沙西泮的MTC为0.060 g/L,灵芝水提物的MTC为1.700 g/L,灵芝粗多糖的MTC为1.800 g/L,灵芝乙醇提取物的MTC为0.600 g/L,灵芝乙酸乙酯相提取物的MTC为0.125 g/L。由图1可知:随着奥沙西泮质量浓度的增加,斑马鱼的死亡数量逐渐增多。这是由于奥沙西泮在生物体内具有生物蓄积性和毒性。研究表明鱼类肌肉中奥沙西泮的质量浓度是奥沙西泮污染水的6倍以上[25]。而高质量浓度的灵芝乙醇提取物、灵芝乙酸乙酯相提取物导致斑马鱼快速死亡。这是由于灵芝乙醇提取物中含有酚类、酮类和三萜类等不溶于水的物质,乙酸乙酯相提取物主要含有三萜类等不溶于水的物质。由此推测,这类不溶于水的物质易沉淀,形成大颗粒物质,而这类大颗粒物质会引起幼鱼的胃肠道消化吸收和呼吸等功能异常。灵芝石油醚提取物对斑马鱼毒性最大,其原因可能是灵芝石油醚提取物主要是油脂类物质,油脂类物质不溶于水,石油醚相提取物配制时要经过超声波处理,油脂颗粒悬浮于水中[26],而斑马鱼长时间处于油脂颗粒的环境会影响其呼吸。

图1 灵芝不同提取物处理斑马鱼的致死率

2.2 灵芝提取物的睡眠改善药效筛选

在研究斑马鱼睡眠实验中,一般选用睡眠时间和活动量作为研究指标,其大小意味着睡眠的长短,也代表着对失眠的改善程度[6,27]。药物对斑马鱼的睡眠改善作用如图2所示,其中:对照组1为水;对照组2为0.1% DMSO;ns表示差异不显著,P>0.05;*表示差异显著,P<0.05;**表示差异极显著,P<0.01,以下同。由图2可知:与空白组相比,咖啡因能明显缩短斑马鱼睡眠回合次数、缩短斑马鱼睡眠时间和增加斑马鱼活动量;与空白组相比,阳性对照品奥沙西泮能明显提高斑马鱼睡眠回合次数、延长斑马鱼睡眠时间和减少斑马鱼活动量。

图2 药物对斑马鱼的睡眠改善作用

经灵芝提取物处理的斑马鱼行为参数见图3。与咖啡因相比,低、中剂量灵芝水提物和中、高剂量灵芝粗多糖均能显著增加斑马鱼睡眠回合次数和睡眠总时间,而高剂量灵芝水提物和低剂量灵芝粗多糖则无此效果。与咖啡因相比,低、中、高剂量灵芝粗多糖和灵芝水提物均能显著减少斑马鱼觉醒活动量。此外,Chu等[4]利用小鼠模型证实灵芝水提取物能显著增加睡眠时间,间接证明灵芝水提取物可以通过增加睡眠时间来改善斑马鱼睡眠。此外,低、中剂量灵芝水提物组处理的斑马鱼睡眠回合次数和睡眠总时间均大于灵芝粗多糖组,而觉醒活动量小于灵芝粗多糖组,说明灵芝水提物助眠效果优于灵芝粗多糖,由此推测灵芝水提物中可能还含有其他助眠成分。

图3 灵芝水提物和灵芝粗多糖对斑马鱼睡眠改善的影响

灵芝提取物对斑马鱼睡眠的影响见图4。与咖啡因相比,中剂量灵芝乙醇提取物均能显著增加斑马鱼的睡眠回合次数和睡眠总时间。与咖啡因相比,3个剂量灵芝乙醇提取物3组试验均能显著减少斑马鱼觉醒活动量。与咖啡因相比,低、中剂量灵芝乙酸乙酯相提取物均能显著增加斑马鱼睡眠回合次数和睡眠总时间,显著减少斑马鱼觉醒活动量。此外,中、高剂量灵芝乙醇提取物处理的斑马鱼睡眠回合次数和睡眠总时间均大于灵芝乙酸乙酯相提取物处理组,而觉醒活动量小于灵芝乙酸乙酯相提取物处理组,说明灵芝乙醇提取物的助眠效果优于灵芝乙酸乙酯相提取物,由此推测灵芝乙醇提取物可能还含有其他助眠成分。

图4 灵芝乙醇提取物和灵芝乙酸乙酯相提取物对斑马鱼睡眠的影响

2.3 灵芝提取物对GABAA受体mRNA相对表达水平的影响

γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统(CNS)中的主要抑制性神经递质,GABA有着多种受体亚基,而GABAA受体能打开氯离子的跨膜通道。GABAA受体与GABA结合,控制大脑的神经元活动,一旦受体功能障碍就容易出现失眠、焦虑、抑郁和癫痫等症状[28]。此外,GABAA受体α亚基对其药理作用也至关重要。GABAA受体α1亚单位具有镇静效应,α2和α3亚单位具有抗焦虑、抗惊厥和肌松作用,而含α5受体的选择性反激活剂能够治疗痴呆症,因此选择GABAA相关受体作为研究基因[19]。各组GABAA相关受体的相对表达量如图5所示。与咖啡因组相比,灵芝粗多糖组斑马鱼幼鱼下调了基因GABRA1和GAD1的表达水平,同时上调了基因GABRA5的表达水平。与咖啡因组相比,灵芝乙酸乙酯相提取物组斑马鱼幼鱼也显著下调了基因GAD1的表达水平,同时显著上调了基因GABRA3和GABRA5的表达水平。说明灵芝粗多糖和灵芝乙酸乙酯相提取物是通过影响GABAA受体部分基因的表达来缓解斑马鱼失眠症状的。

图5 各组GABAA相关受体的相对表达量

2.4 灵芝提取物对其他神经递质受体mRNA相对表达水平的影响

谷氨酸对神经细胞具有兴奋作用,谷氨酸受体过度激活容易引起兴奋毒性[29]。5-HT及其受体能够调节睡眠和觉醒[30]。研究发现不表达5-HT1A受体的突变小鼠比野生型小鼠出现更多的快动眼睡眠(REMS)时间[31]。血清素通过血清素-N-乙酰转移酶(NAT)和羟基吲哚-O-甲基转移酶转化为褪黑激素[32]。褪黑素(MTN)是由松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,它能将日常光照和黑暗循环的信息传递给身体,从而间接调节昼夜节律系统[32]。有报道指出,褪黑素受体MT1和MT2可能与睡眠障碍有关[31],故选择GRIN2A,HTR1A,HTR2A,MTNR1A作为研究基因。各组5-HT相关受体的相对表达量如图6所示。与咖啡因组相比,灵芝粗多糖组斑马鱼幼鱼显著下调了基因GRIN2A的表达,显著上调了基因MTNR1A,HTR1A,HTR2A的表达。同时与咖啡因组相比,灵芝乙酸乙酯相提取物组斑马鱼幼鱼均显著上调了基因GRIN2A,MTNR1A,HTR1A的表达。说明灵芝粗多糖下调了基因GRIN2A的表达,上调了基因MTNR1A,HTR1A,HTR2A的表达,从而改善了斑马鱼的睡眠;灵芝乙酸乙酯相提取物上调了基因GRIN2A,MTNR1A,HTR1A的表达,从而增加了斑马鱼的睡眠时间。

图6 各组5-HT相关受体的相对表达量

3 结 论

研究证实了灵芝水提物、灵芝乙醇提取物、灵芝粗多糖和灵芝乙酸乙酯相提取物均对睡眠剥夺斑马鱼具有睡眠改善作用。在助眠效果上,灵芝水提物大于灵芝粗多糖,灵芝乙醇提取物大于灵芝乙酸乙酯相提取物。推测灵芝水提物和乙醇提取物中还有其他未知的助眠成分。此外,研究发现灵芝粗多糖能显著降低斑马鱼GABRA1,GRIN2A,GAD1mRNA的表达,上调GABRA5,MTNR1A,HTR1A和HTR2A基因的表达水平,从而改善斑马鱼的睡眠。灵芝乙酸乙酯相提取物能显著降低斑马鱼GAD1mRNA的表达水平,上调GABRA3,GABRA5,GRIN2A,MTNR1A和HTR1A基因的表达水平,从而缓解失眠。研究结果为进一步开发灵芝新药以及探索中药改善睡眠的新途径提供理论依据,同时对食用菌的生物活性研究具有重要意义。