蛋白乙酰化修饰对沙门氏菌感染作用的影响

狄传远,付道斌,陈 晨,刘 伟*

(1.扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009;2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009)

沙门氏菌(Salmonella)属肠杆菌科人兽共患革兰氏阴性菌,其感染可以引起人和动物的伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症,还可以造成怀孕母畜发生流产,导致畜禽死亡,还会因畜禽生长迟缓、产量下降等原因造成重大经济损失。沙门氏菌也是人类食物中毒的主要病原之一,具有重要的公共卫生学意义[1]。目前,已确认2 500多个沙门氏菌血清型,据估计每年沙门氏菌会引起9 300万例肠道感染,导致15.5万人死亡[2]。沙门氏菌致病性是由于大量毒力相关因子相互作用的结果从而导致机体感染,而这些与沙门氏菌毒力相关的因子主要分布在毒力岛、毒性质粒和菌毛等。沙门氏菌毒力基因存在其染色体和质粒中,在沙门氏菌染色体中编码毒力相关基因的特定区域被称为沙门氏菌致病岛(Salmonellapathogenicity island,SPI),含有许多与毒力相关的基因,还编码与细菌侵袭力直接相关的Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)[3]。T3SS是一种针状结构,将效应蛋白注入宿主细胞质基质。SPI-1参与沙门氏菌入侵非吞噬细胞,而SPI-2则与沙门氏菌在宿主吞噬细胞中的生存和增殖有关[4]。当沙门氏菌通过受污染的水或食物进入宿主时,它们会侵入宿主的胃肠上皮,并释放由SPI编码的效应蛋白。这些细菌效应物会改变宿主肌动蛋白细胞骨架的结构,从而激活宿主的信号转导途径,导致宿主上皮细胞的细胞膜增大和皱折。这种改变的宿主细胞会以吞噬细胞的形式吞噬沙门氏菌,随后由细胞膜组成的液泡将沙门氏菌包围[5]。

沙门氏菌在从口腔到小肠的过程中会遇到各种环境变化,包括温度、pH、渗透压、营养物质的变化,以及宿主免疫反应的生化变化。而沙门氏菌则使用一个双组分系统来调节与其毒力和生存相关的基因的表达,从而适应环境变化。这个双组分系统由识别外部信号的组氨酸激酶和起转录调节作用的反应调节器组成。当组氨酸激酶被自动磷酸化时,这些磷酸化基团随后被转移到反应调节器上。磷酸化的反应调节器随后被激活并与DNA结合以调节蛋白转录[6]。细菌可以通过适当地调节转录和翻译来识别和适应变化的环境。然而,细菌的响应性适应是耗时和耗能的。相对而言,翻译后修饰可以更快地调节细菌的生理功能。

翻译后修饰(PTMs)是蛋白质中氨基酸残基共价修饰的生化机制。质谱等新的试验技术帮助确定了大量的PTM位点,并揭示了各种修饰的重要性。目前,已鉴定出200多种不同类型的翻译后修饰,包括从小的化学修饰(例如磷酸化和乙酰化)到添加完整的蛋白质(例如泛素化)。对于某一种蛋白质,不同的PTM可以组合在一起,它们的开关状态在不同的条件下会有所不同,从而微调它们的活性、定位以及与其他蛋白质的相互作用。

赖氨酸是一种带有疏水侧链的两亲性残基,具有一个正电荷的Nɛ基团。赖氨酸的酰化作用中和了氨基的正电荷,可能会改变蛋白质的构象。目前已鉴定出多种酰基化,但是研究最多的赖氨酸酰化修饰是乙酰化。这种修饰首先在组蛋白上被发现。后来,更多的真核非组蛋白被鉴定可以发生乙酰化。这些乙酰化参与细胞代谢、细胞周期、衰老、生长、血管生成和癌症[7]。相比之下,原核生物中的乙酰化研究较少,有限的研究主要集中在少数微生物物种上。在这篇综述中,我们主要集中在蛋白质翻译后修饰方式之一乙酰化与沙门氏菌感染的关系。

1 沙门氏菌中的赖氨酸乙酰化系统

沙门氏菌有两种类型的蛋白质赖氨酸乙酰化系统。第1种是酶系统,其中蛋白质赖氨酸残基被蛋白质乙酰转移酶(protein acetyltransferase,Pat)乙酰化[8]。GNAT(gcn5-related N-acetyltransferase)家族是重要的赖氨酸乙酰转移酶(lysine acetyltransferase,KATs)之一,是大多数细菌KATs的组成部分[9]。Pat属于GNATs家族,以乙酰辅酶A为底物。它的首次报道发现Pat与依赖NAD+的去乙酰化酶CobB一起调节乙酰辅酶A合成酶的活性[10-11]。第2种类型的蛋白质赖氨酸乙酰化体系依靠乙酰磷酸(acetyl phosphate,ACP)的非酶反应。ACP是参与Pta-AckA途径的高能中间体,可以提供磷酸基和乙酰基[12]。通过敲除AckA基因获得的ACP过量的突变体与通过同时敲除Pta和AckA基因获得的ACP生产缺陷的突变体之间的比较表明,ACP可以乙酰化许多蛋白质[9]。

2 乙酰化稳态对细菌耐酸性的影响

一般情况下,肠道病原体鼠伤寒沙门氏菌必须在胃的强酸性环境中生存,直到它们能够进一步侵入肠道上皮和其他器官,包括脾脏和肝脏。耐酸性对于巨噬细胞内细菌的生存和复制是必要的,而破坏参与酸反应调控的基因则会导致细菌毒性的衰减。因此,沙门氏菌对酸性环境的感知和反应能力对其毒力和致病作用至关重要。酸胁迫可以全面下调乙酰化水平,RNA转录组图谱显示,酸胁迫信号可能通过调控Pat的转录和细胞内NAD+/NADH的比例来降低乙酰化水平。该研究构建了沙门氏菌株的Pat突变体和CobB突变体,与野生型菌株在对数期和生长静止期比较耐酸性相比,酸胁迫的突变菌株中会下调Pat的正调节因子基因CyaA和Crp的转录水平,同时与酸胁迫下的野生型菌株和CobB缺失株相比,Pat突变株的细胞内pH更稳定,并显示出更高的存活率[13]。这些研究表明,较低的乙酰化水平有利于增强沙门氏菌的耐酸性,并提示乙酰化可通过促进耐酸性来调节病原在肠道中的毒力水平。

3 乙酰化调节沙门氏菌致病性岛1(SPI-1)调节因子HilD的活性和稳定性

沙门氏菌通过表达SPI-1编码T3SS-1基因以穿透宿主上皮细胞。在T3SS-1基因中,SPI-1编码关键的转录调节因子,如HilD、HilA和InvF。HilD是一种AraC型显性调控因子,不仅影响HilA的转录,还影响SPI-1以外的许多基因的转录[4,14]。研究表明,乙酰化和毒力之间关系的其他直接证据是来自沙门氏菌Pat缺失株的毒力表型[15]。Pat的缺失减少了SPI-1的表达,降低了沙门氏菌对HeLa细胞的侵袭,并削弱了沙门氏菌在巨噬细胞内的复制。在小鼠模型中,尽管CobB缺失株似乎没有毒力缺陷,但与野生型相比,Pat缺失株的毒力有所减弱。乙酰化相关的毒力调节可能是由在SPI-1内占据调控级联的顶端位置的关键转录调控因子HilD介导的。此外,Pat对HilD的乙酰化保障了HilD的稳定性,这对SPI-1的激活是必不可少的。赖氨酸297(K297)是Pat的底物残基,位于HilD的螺旋-转角-螺旋基序中。有研究证明K297的乙酰化增强了HilD的稳定性,但降低了它与DNA结合的能力。与K297去乙酰化的沙门氏菌相比,K297乙酰化的沙门氏菌在HeLa细胞中的侵袭性减弱,在小鼠模型中的毒力减弱,这表明K297的去乙酰化对沙门氏菌的毒力是必不可少的[16]。因此,赖氨酸残基K297的乙酰化既调节了HilD的蛋白稳定性,又调节了其与DNA的结合能力。这种新的调控机制维持了细胞中适量的HilD的数量和活性,因为大量的HilD不利于细菌在宿主细胞内的生长,而适当的去乙酰化的HilD保证了其与DNA的结合活性,从而提高了细菌的致病性。然而,乙酰化调节HilD的稳定性的潜在机制仍未被完全阐明。

4 乙酰化调节Phop/PhoQ的活性以影响毒力基因的表达

细菌使用多种双组分系统来识别外部环境信号,并调节各种基因的表达以适应这些信号。其中双组分系统PhoP/PhoQ是由位于细菌细胞膜上的组氨酸激酶PhoQ和在细胞质中发挥作用的反应调节因子PhoP组成[6]。在宿主巨噬细胞中,当细胞膜上的PhoQ组氨酸激酶接收到低镁离子浓度、酸性应激和抗菌肽等信号时,它会自磷酸化并被激活。随后自磷酸化的PhoQ会引起细胞质中的PhoP响应调节器的磷酸化。磷酸化的PhoP通过与靶基因启动子结合来启动转录,以促进RNA聚合酶的募集,调节约5%的鼠伤寒沙门氏菌基因的转录[17]。已知PhoP/PhoQ系统可调节诸如鼠疫耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌等革兰氏阴性病原体毒力基因的表达[18-20]。而PhoP/PhoQ在发挥作用时受到各种因素的影响,例如在弱酸条件下RNA伴侣CspC会促进PhoP的激活[21];甲基转移酶CheR通过对PhoP的甲基化负调控来调节其活性[22];抑制蛋白 EIIANtr通过干扰 PhoP 与 DNA 的结合来阻碍 PhoP对其调节基因的激活[23]。此外,一项沙门氏菌PhoP的研究表明乙酰化在沙门氏菌毒力中起着重要作用。PhoP可以分别被Pat和CobB乙酰化和去乙酰化。尤其是位于PhoP 羧基端DNA结合域的赖氨酸201(K201)能够被Pat乙酰化。当沙门氏菌处于低浓度Mg2+、酸胁迫环境或由于宿主细胞吞噬而出现在巨噬细胞中时,PhoP的K201乙酰化水平迅速下降。当沙门氏菌缺失Pat基因后,PhoP与DNA的结合活性增加。此外,与野生型菌株相比,用谷氨酰胺替代赖氨酸201残基来模拟乙酰化状态可降低细菌的致病性[24]。这些结果表明PhoP的 DNA结合域的赖氨酸乙酰化抑制了其与DNA的结合活性,从而抑制了其对沙门氏菌致病基因表达的促进作用。

有研究表明,无论在革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌中,PhoP受体结构域中的赖氨酸102残基(K102)都是保守的。但在富含乙酰磷酸(ACP)的条件下,鼠伤寒沙门氏菌的PhoP中共有5个赖氨酸残基可以乙酰化,其中包括赖氨酸102。该残基的乙酰化反应依赖于ACP的剂量,而不依赖于Pat和CobB。当赖氨酸102残基被乙酰化时,PhoP在体外不被磷酸化。同时模仿非乙酰化形式的PhoP K201R突变体,发现PhoP能够与DNA结合,并上调PhoP和PhoP靶基因。在用精氨酸取代PhoP K201和K102的菌株中,PhoP和PhoP靶基因的转录减少[17,24]。因此,可以认为ACP介导的PhoP K102乙酰化,通过终止PhoP活性所必需的PhoP磷酸化来降低沙门氏菌毒力基因的表达。研究发现,PhoP 的一个高度保守的赖氨酸残基K88可以被ACP而非Pat特异性乙酰化,这削弱了PhoP的二聚体形成并抑制其与DNA结合的能力,从而影响PhoP的活性并导致沙门氏菌毒力的减弱[25]。这些研究都表明沙门氏菌的毒力可以被在PhoP的赖氨酸残基处的乙酰化所影响,而且未来可能会发现更多的赖氨酸残基位点影响沙门氏菌的毒力。

5 某些转录调节因子的赖氨酸乙酰化对沙门氏菌毒力的影响

鼠伤寒沙门氏菌中的Lon蛋白酶可以引起入侵蛋白的水解和毒力的负调节。Lon是一种应激诱导的依赖ATP的蛋白酶,是HilD的负调控因子[26]。并且有研究通过质谱分析发现,HilD的赖氨酸23、34和132位点是部分乙酰化的,而HilD的赖氨酸297是完全乙酰化的。此外,用谷氨酰胺取代HilD的赖氨酸297(模拟乙酰化形式)会影响沙门氏菌对HeLa细胞的入侵,导致HilD与DNA的结合活性存在缺陷[16]。因此,乙酰化的HilD无法与DNA结合从而降低沙门氏菌的毒力,但Lon蛋白酶是否参与到HilD的乙酰化过程来调节入侵蛋白的水解和毒力还有待进一步探索。

还有其他转录因子,如Lrp和RcsB也受到乙酰化的影响[27-28]。Lrp是一个全局性的调控因子,大概参与大肠埃希氏菌10%的基因表达。在鼠伤寒沙门氏菌中,它调节编码Ⅰ型菌毛的薄膜操纵子,会刺激细菌和肠道细胞之间的结合,从而促进其致病性[29]。有研究证实鼠伤寒沙门氏菌的Lrp在体外可以分别被Pat和CobB乙酰化和去乙酰化,乙酰化位点是其DNA结合域的螺旋-转角-螺旋(HTH)基序中的第36个赖氨酸(K36)残基。它的乙酰化抑制了其与DNA的结合,减少了Lrp调控基因(菌毛)的转录,从而削弱了沙门氏菌的致病性。RcsB是一种反应调节因子和转录因子,通过与RcsC和RcsD形成一个双组分系统来调节肠杆菌科的基因转录[30]。当细菌收到外部信号时,RcsC发生自磷酸化;然后RcsC上的磷酸基通过RcsD传递到RcsB。磷酸化的RcsB与其共激活子RcsA或转录因子BglJ和GadE形成一个同源二聚体或多个异源二聚体,以控制150多个大肠埃希氏菌基因[30]。有研究证实位于与DNA结合的HTH基序中的RcsB的第180个赖氨酸(K180)残基被沙门氏菌乙酰转移酶Pat和大肠埃希氏菌同系物YfiQ乙酰化,并在体外被CobB去乙酰化。但Pat对RcsB 上的K180的乙酰化是可逆的,可以改变DNA结合活性,从而影响相关毒力基因表达[31]。这些乙酰化位点的发现进一步解释了沙门氏菌感染后毒力调节的机制,说明这些修饰位点是相关药物研制的重要参考。

6 展望

在包括沙门氏菌在内的许多细菌中,乙酰化是一种翻译后动态修饰过程,可以控制蛋白质的酶活性、亚细胞定位、蛋白质之间的相互作用、蛋白质的稳定性以及DNA结合活性。赖氨酸乙酰化是各种乙酰化形式中研究最深入的。本文从其对蛋白质功能影响的角度,综述了赖氨酸乙酰化对沙门氏菌基因表达的调控及其毒力的影响。由于酸性环境对沙门氏菌的毒力和致病作用很重要,所以在对由沙门氏菌引起的相关疾病的治疗中可以根据这一特点来抑制其生长,但是在酸性环境中沙门氏菌是否还会通过非酶途径来影响自身的耐酸性还有待进一步探索。另外,无论是依赖于Pat还是依赖于ACP的赖氨酸乙酰化都能抑制相关蛋白质活性从而影响其致病性。通过以上的分析发现细菌毒力是一个非常复杂的表型,这其中涉及到多种因素,无法通过单个的蛋白质翻译后修饰来解释。未来的研究可能会发现其他调节毒力因子活性的翻译后修饰。

目前,一些与毒力相关的蛋白质,包括PhoP和HilD,已经被证明可以发生乙酰化。这些研究表明蛋白质乙酰化在细菌毒力中起着重要的作用。然而,还需要更多的研究来揭示蛋白质乙酰化对细菌毒力的影响和探索相关修饰位点与其致病性的关系,并解释蛋白质乙酰化调节细菌毒力的潜在机制,为今后研究治疗由沙门氏菌引起相关疾病的药物提供理论支撑。