T-2毒素神经毒性研究进展

杨 旭,王优爽,陈凤娟,陈云贺,陈 中,刘 雨,宋汶羲,黄婷玉,张珂菲,张 丛

(河南农业大学,河南郑州 450000)

T-2毒素由镰刀菌产生的霉菌毒素,也是毒性最强的A型单端孢霉烯族化合物,具有极强的消化、免疫、神经和循环等多系统毒性。T-2毒素理化性质稳定,常温下可保存6～7年,其毒性可在200～210℃高温中保持40 min,在NaClO-NaOH溶液中保持4 h毒性不减[1]。T-2毒素广泛分布于自然界中,有数据统计全球75个国家8721种农作物,其中23%农作物受到T-2毒素污染,平均含量为25 μg/kg,其中22%小麦受T-2毒素污染,最大含量达163 μg/kg[2];2019年,新疆部分地区鸡场豆粕和玉米等饲料原料中发现T-2毒素检出率均高于50%[3];在青海地区60户农户的小麦主粮中均检出T-2毒素[4]。T-2毒素可通过皮肤/黏膜、呼吸道、消化道等途径吸收进入机体,而发挥毒性作用[5]。

神经系统分为中枢神经系统和外周神经系统两大部分。中枢神经系统包括脑和脊髓,外周神经系统包括脑神经、脊神经和植物神经。中枢神经系统接受全身各处的传入信息,经它分析综合后传出至全身各处,对调节器官功能活动、机体稳态和意识思维至关重要。T-2毒素具有神经毒性,可破坏血脑屏障进入脑组织导致中枢神经系统损伤,危害机体正常生命活动。T-2毒素不但影响神经递质的产生和传递,而且导致脑细胞中活性氧(ROS)堆积引起氧化应激,引发脑细胞凋亡和脑组织损伤。T-2毒素甚至能穿过胎盘屏障损伤子代中枢神经系统[6]。IgA肾病、克山病、大骨节病等可能与T-2毒素污染有密切联系[7]。阿尔茨海默病和帕金森病可能与真菌毒素中毒诱导的神经系统损伤有关[8]。有报道指出人因食用拟枝孢镰刀菌和早熟禾镰刀菌污染的谷物而引起T-2毒素中毒,出现眩晕和黏膜出血等神经症状[9]。因此,论文综述了T-2毒素神经毒性的最新研究进展,系统总结了T-2毒素神经毒性的机制及未来研究需要关注的重点和发展趋势,为研究T-2毒素神经毒性机制和发掘缓解T-2毒素神经毒性的靶标药物提供理论参考。

1 T-2毒素对脑组织的影响

大脑控制机体的情感、感觉、运动、语言、生命活动和执行功能,大脑的结构和功能稳定对机体正常生命活动至关重要。目前对T-2毒素神经毒性在神经系统器官方面的研究主要集中在大脑组织。

1.1 T-2毒素对脑组织的毒性作用

每天给猫口服T-2毒素15 mg/只,连续17 d后尸检,猫的脑膜广泛出血,表明T-2毒素能损伤脑组织[7]。经皮注射给白化小鼠T-2毒素5.94 mg/kg BW,在第1、3、7 天分别处死小鼠,病理组织学检测发现小鼠大脑血管扩张通透性增加[7]。给白化小鼠静脉注射2、4、6 μg/kg BW T-2毒素,24 h后HE染色发现小鼠大脑和海马体胶质细胞增生,病灶区有炎性细胞浸润,显微镜观察胶质细胞和神经细胞发生凋亡[10]。给大鼠灌胃T-2毒素2 mg/kg 7 d后,组织学分析发现大鼠脑实质和锥体细胞层出血和脑血管水肿;垂体前叶充血、垂体细胞间隙出血和细胞核深染。大鼠脑实质和垂体前叶线粒体超微结构显示,线粒体肿胀、空泡、嵴脱落和膜结构受损[9]。给小鼠腹腔注射T-2毒素(4 mg/kg) 14 d后,HE染色大脑皮层神经元显示神经元萎缩、细胞肿胀和细胞周围间隙扩大和大出血,同时TUNEL染色阳性细胞增多,表明T-2毒素可以诱导神经细胞凋亡[11]。以上研究表明,T-2毒素能引起脑组织充血出血、脑组织炎性细胞浸润,神经元细胞线粒体损伤和神经细胞凋亡。

1.2 T-2毒素损害血脑屏障结构

血脑屏障是血浆与脑组织之间的保护性结构屏障,主要由脑微血管内皮细胞、基膜、星形胶质细胞、周细胞以及小胶质细胞组成。血脑屏障可选择性地控制物质进入脑组织,阻止毒素和病原微生物等有毒有害物质等进入脑组织,对维持脑内环境稳定至关重要[12]。血脑屏障允许水、气体和脂溶性物质通过[13],因T-2毒素有亲脂性,故T-2毒素可能通过血脑屏障进入脑组织,对脑组织产生毒性作用。

给大鼠灌胃T-2毒素2 mg/kg 7 d后,在大鼠脑内检测到0.012 μg/mL T-2毒素,表明T-2毒素可通过血脑屏障进入脑组织中[9]。给白化小鼠经皮注射T-2毒素5.94 mg/kg,在第1、3或7天分别处死小鼠,用伊文斯蓝染料外渗法发现在第1和第3天中小鼠脑组织中伊文思蓝染料呈时间依赖性增加,且病理组织学检测发现脑组织血管扩张和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达升高,表明T-2毒素增加了血脑屏障通透性[7]。基质金属蛋白酶能降解细胞外基质和连接蛋白并进一步增加细胞通透性,MMP-9在血脑屏障通透性中发挥重要作用[14]。同时,给大鼠腹腔注射T-2毒素0.2 mg/kg或1.0 mg/kg并给予外源甘露醇2 h后,检测到脑内甘露醇含量呈剂量依赖性增加;对大鼠喂食含T-2毒素2.5 mg/kg或10 mg/kg的饲料7 d后,大鼠脑内甘露醇含量也增加[15]。以上研究表明,T-2毒素可通过破坏血脑屏障进入脑组织,从而产生神经毒性。但在脑内检测到的T-2毒素含量相对较低,T-2毒素含量较低的原因是否为T-2毒素在组织中代谢过快?或相比于其他系统神经系统的敏感性更高,即使低剂量的T-2毒素也会破坏血脑屏障,进入脑组织导致神经毒性?以上问题,有待进一步研究,研究结果有助于阐明T-2毒素破坏血脑屏障的分子机制。未来研究中以“维持血脑屏障稳态,阻止T-2毒素进入脑组织”为出发点,或将有助于发掘能够拮抗T-2毒素神经毒性的靶标药物。

2 T-2毒素对神经细胞的影响

2.1 T-2毒素破坏神经细胞间连接

细胞间的紧密连接是相邻细胞间质膜紧密结合,能防止溶液中的分子沿细胞间隙渗入体内,保证机体内环境相对稳态。紧密连接具有很重要的功能,如脑血管内皮细胞的紧密连接形成密集的屏障对维护血脑屏障稳定具有重要作用。将原代猪脑毛细血管内皮细胞(PBCEC)培养于Transwell小室中模拟体外血脑屏障模型。随后用10 nmol/L和25 nmol/L的T-2毒素处理血脑屏障细胞模型24 h和48 h后,在Transwell小室另一侧检测到T-2毒素,提示T-2毒素可以破坏PBCEC间紧密连接,透过细胞间隙。同时,用50 nmol/L或75 nmol/L处理PBCEC 24 h后,发现紧密蛋白Occludin表达降低,表明T-2毒素可以破坏血脑屏障的紧密连接结构[16]。人脑微血管内皮细胞(hBMEC)是成熟的体外研究血脑屏障模型的细胞系,因其跨膜电阻较大,NaF渗透率低而被广泛用于血脑屏障损伤研究中[9]。hBMEC间紧密连接是构成血脑屏障的关键结构,T-2毒素可降低hBMEC细胞紧密连接相关蛋白的表达,进而导致血脑屏障通透性增加的损伤。用20、40、80 nmol/L T-2毒素孵育hBMEC细胞24 h后,发现细胞跨膜电阻降低、NaF渗透率增加和紧密连接蛋白ZO-1、Occuldin和Cldn5表达降低[9]。胶质细胞是血脑屏障结构组成成分之一且对T-2毒素敏感。T-2毒素可快速富集进入胶质细胞中,对胶质细胞造成损伤,进一步破坏血脑屏障。用10 μmol/L T-2毒素培养原代人星形胶质(NHA)细胞和人结肠癌细胞系(HT-29细胞),15 min时检测到NHA细胞和HT-29细胞内T-2毒素浓度分别达到了200 μmol/L和150 μmol/L,提示NHA细胞对T-2毒素更敏感[10]。水通道蛋白(AQP)维持大脑和其他器官的水稳态和血脑屏障的功能。AQP4是中枢神经系统中最丰富的水通道蛋白,在星形胶质细胞足突中表达,促进脑内水的流动、星形胶质细胞的迁移和神经兴奋[17]。给小鼠静脉注射T-2毒素2、4、6 μg/kg,24 h后发现AQP4基因表达降低,大脑水通透性增加[10]。

以上研究表明,T-2毒素通过破坏细胞间紧密连接,进而破坏血脑屏障。保护细胞间紧密连接对维护血脑屏障功能的研究值得进一步深入。

2.2 T-2毒素诱导神经细胞氧化应激和细胞凋亡

氧化应激是指机体的抗氧化水平和氧化水平失衡,导致产生过量的ROS,从而对细胞和组织产生氧化损伤。由于脑组织在生命活动中对氧的需求量高、对不饱和脂质代谢率高,当发生氧化应激时更易受到ROS的攻击[11]。研究表明,T-2毒素的毒性机理主要是诱导产生氧化应激和细胞凋亡。

对妊娠第6天到分娩第21天母鼠饲喂含T-2毒素1、3、9 mg/mL的饲料,检测到小鼠的星形胶质细胞和海马神经干细胞中的金属硫蛋白表达增加,这表明氧化应激在T-2毒素诱导的发育性神经毒性中发挥着关键作用[18]。用10 nmol/L或40 nmol/L T-2毒素处理大鼠垂体细胞 (GH3细胞)8 h后发现ROS含量增加,处理24 h后发现抗氧化酶SOD和GSH-Px表达升高,表明GH3细胞发生氧化应激。同时,用20、40、80 nmol/L T-2毒素孵育hBMEC细胞,24 h后发现抗氧化酶SOD和GSH-Px表达升高,表明hBMEC细胞也发生氧化应激[9]。用10 ng/mL T-2毒素处理人母细胞瘤(IMR-32细胞),48 h后产生ROS(15 min内被检测到,60 min达到峰值),表明细胞发生氧化应激。同时,用流式细胞术分析发现凋亡细胞呈时间依赖性增加,凋亡蛋白caspase-3表达增加,表明发生细胞凋亡[7]。用3 mg/kg T-2毒素处理怀孕小鼠,发现其中枢神经系统有细胞凋亡现象[6]。给小鼠静脉注射T-2毒素2、4、6 μg/kg,处理24 h后发现脑组织中胶质细胞增生,神经上皮细胞凋亡。用20、40、80 ng/mL T-2毒素处理小鼠脑神经瘤细胞(N2a细胞)24 h后,发现ROS和氧化应激标志物MDA含量升高、GSH含量和SOD和CAT活性降低,表明T-2毒素导致N2a细胞发生氧化应激;凋亡蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-8和caspase-9表达升高,导致细胞凋亡[10]。用10 nmol/L或40 nmol/L T-2毒素处理GH3细胞,24 h后发现T-2毒素以剂量依赖性的方式增加ROS水平,显著降低GSH水平,增加抗氧化酶GSH-Px、SOD和CAT表达量,说明细胞内发生氧化应激;同时抗凋亡基因Bcl-2表达被抑制、促凋亡基因Bax和凋亡蛋白p53、caspase-3和caspase-8表达升高,提示细胞凋亡[19]。

核红细胞2相关因子2(Nrf2)是内源性抗氧化通路,对ROS非常敏感,机体产生的ROS激活Nrf2通路,激活Nrf2通路提高抗氧化酶活性,缓解ROS带来的氧化应激损伤[20]。在N2a细胞中,用10、20、40、80 ng/mL T-2毒素处理24 h后,检测到ROS和MDA含量升高、凋亡相关基因p53、Bax和caspase-8表达上调和Nrf2/HO-1通路被抑制,说明T-2毒素通过抑制Nrf2通路导致N2a细胞产生氧化应激损伤和细胞凋亡[21]。用5 ng/mL或10 ng/mL T-2毒素处理人神经母瘤细胞(SH-SY5Y细胞)24 h后,检测到ROS水平升高,还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值降低,表明SH-SY5Y细胞发生了氧化应激。同时,激活Nrf2通路后显著缓解T-2毒素诱导SH-SY5Y细胞产生的氧化应激,敲除Nrf2基因后加重T-2毒素诱导SH-SY5Y细胞产生的氧化应激和细胞凋亡损伤。表明Nrf2通路在T-2毒素导致的SH-SY5Y细胞氧化应激和细胞凋亡具有重要作用[20]。用1.25、2.5、5 ng/mL T-2毒素处理小鼠小胶质细胞(BV2细胞)24 h后,检测到ROS和MDA含量升高、抗氧化酶CAT和SOD活性降低、促凋亡蛋白Bax和凋亡标志蛋白caspase-3表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达和抑制Nrf2表达降低,表明T-2毒素通过抑制Nrf2通路导致BV2细胞产生氧化应激并伴随细胞凋亡[22]。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)对微量T-2毒素敏感,将PC12神经细胞用作神经元模型细胞。用0.75、1.5、3、6、12 ng/mL T-2毒素处理PC12细胞24 h后,发现ROS和MDA含量升高、GSH含量和SOD和CAT活性降低、凋亡蛋白Bax、caspase-3和caspase-9表达增加和Nrf2活性受到影响,表明T-2毒素通过影响Nrf2通路导致PC12细胞氧化应激和细胞凋亡。T-2毒素浓度小于6 ng/mL时Nrf2表达升高,而T-2毒素浓度大于6 ng/mL时,Nrf2表达降低。对于不同浓度T-2毒素对Nrf2分子活化的双向作用可能体现了T-2毒素引起氧化应激的动态过程,表明T-2毒素对Nrf2活化的影响取决于T-2毒素的剂量。高迁移率族B1蛋白(HMGB1蛋白)可以触发和调节炎症,激活HMGB1可诱导氧化应激和细胞凋亡。T-2毒素处理PC12细胞后,HMGB1蛋白表达增加并伴随PC12细胞氧化应激和凋亡,HMGB1 siRNA缓解了T-2毒素导致的PC12细胞氧化应激和细胞凋亡和神经炎症爆发,表明HMGB1分子在T-2毒素神经毒性中发挥关键调节作用[8]。神经炎症与神经胶质细胞增生、氧化应激、线粒体功能障碍和炎症信号通路NF-κB和MAPK激活有关。神经炎症可促进促炎细胞因子TNFα、IL-6、IL-8和IL-1β分泌,进而导致突触功能障碍、神经发生抑制和神经元死亡[23]。

T-2毒素导致动物脑组织产生过量ROS、降低抗氧化酶的活性和影响Nrf2通路活性从而导致神经细胞氧化应激和细胞凋亡,造成神经系统氧化损伤。细胞在低剂量T-2毒素下,通过活化Nrf2通路来可应对大量ROS的产生,但细胞仍处于氧化应激状态,如何加强Nrf2通路的抗氧化效应,有待进一步探究。

3 缓解T-2毒素神经毒性作用研究

缓解T-2毒素神经毒性的研究相对较少,处于起步阶段。氧化应激是T-2毒素引发神经毒性的核心机制。因此,现阶段试图缓解或治疗T-2毒素神经毒性的研究主要以提高抗氧化能力,减少ROS产生,缓解神经细胞氧化应激为出发点。

桦木酸是一种植物源性五环三萜类物质,具有多种生物活性,如抗氧化应激、抗疟疾、抗肿瘤、抗炎、抗艾滋病毒、提高机体免疫力以及保护认知等功能等[11]。给小鼠灌胃桦木酸0.25、0.5、1 mg/kg 14 d,在14 d时腹腔注射4 mg/kg T-2毒素,发现桦木酸缓解了T-2毒素引起脑组织中神经递质5-HT、DA和ACH水平下降,降低脑组织中ROS和MDA蓄积,提高GSH水平,增加GSH-Px、SOD和CAT活性,抑制促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达和提高抗炎因子IL-10的表达;同时,HE染色显示随桦木酸剂量增加小鼠大脑出血明显减少。表明桦木酸对T-2毒素导致的脑组织氧化损伤具有保护作用,减少脑组织出血和细胞凋亡[15]。氧化应激可以诱导炎性反应,而炎性反应又可以进一步加重氧化应激,两者构成的恶性循环加速细胞损伤,进而增加脑组织损伤。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)能够调控多种SOD、GPX和CAT等抗氧化酶的表达,降低细胞内ROS水平和氧化应激损伤。PGC-1α在大脑区域特别丰富,对多种疾病引起的血脑屏障损伤中起保护作用[9]。研究发现,抑制PGC-1α表达后,降低GH3细胞中抗氧化酶SOD和GSH-Px活性和hBMEC细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Cldn5的表达,进一步加重T-2毒素导致的GH3细胞氧化应激和hBMEC细胞紧密连接损伤。相反,PGC-1α的过表达能缓解T-2毒素引起的氧化应激和紧密连接损伤。表明PGC-1α在拮抗氧化应激和血脑屏障损伤中发挥重要作用。同时,中药小分子化合物3-131可以激活PGC-1α的表达。用50 μg/mL的3-131预孵育hBMEC细胞2 h后加入80 nmol/L T-2毒素共处理24 h,发现细胞内PGC-1α表达增加、细胞跨膜电阻增加、NaF渗透率降低和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Ocldn5表达增加。对大鼠单次腹腔注射30 mg/kg的3-131 4 h后,再单次皮下注射1.57 mg/kg T-2毒素3 d后处死,发现小鼠脑组织海马区神经元数量增加、变性神经元减少和脑组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Ocldn5表达增加,表明中药小分子化合物3-131可通过激活PGC-1α缓解T-2毒素引起的氧化应激和血脑屏障损伤。因此,PGC-1α可作为缓解T-2毒素引起神经损伤的一个潜在靶点,为开发以PGC-1α为靶点缓解T-2毒素引起的神经损伤和血脑屏障损伤的药物提供研究方向[9]。硒元素是一种有益金属元素,具有抗炎、抗氧化、抗癌等优点,又作为谷胱甘肽的主要成分,在机体发挥抗氧化功能。研究发现低硒条件下会加剧T-2毒素导致的脑组织氧化损伤,适量补硒能预防T-2毒素引起的脑组织氧化损伤[24]。中国许多植物中草药具有很好的抗氧化作用,且副作用较小,是天然的抗氧化剂。目前天然抗氧化剂缓解大脑氧化损伤是研究热点。用50 mg/kg白藜芦醇灌胃小鼠3、7、9周后,能改善小鼠慢性脑缺血造成的脑损伤,降低氧化应激和减少神经细胞凋亡[25]。葛根素可缓解重金属镉引起的大鼠大脑皮层的氧化应激损伤[26];银杏提取物可缓解多种因素引起的氧化损伤和神经系统损伤[15];茶叶中的茶多酚可能通过ROS/NO通路,降低细胞中ROS的积累,从而缓解细胞氧化损伤[27]。通过抗氧化效应,发掘能够缓解T-2毒素神经毒性的中草药的活性成分以及中草药非药用部位中活性成分,或成为解除T-2毒素神经毒性的有效治疗手段。

4 展望

T-2毒素能破坏血脑屏障进入大脑,诱导脑细胞产生ROS、抑制抗氧化通路和抗氧化酶活性,引发神经细胞氧化应激和细胞凋亡。目前关于T-2毒素神经毒性机制的研究相对较少,多数研究集中T-2毒素引起神经细胞氧化-还原失衡方面。目前对缓解T-2毒素神经毒性的药物也仅基于恢复抗氧化能力,减轻ROS蓄积。鉴于血脑屏障的特殊性,未来可通过维持血脑屏障的功能,发掘能够高效通过血脑屏障的天然植物提取物或药物载体或增加血脑屏障的功能,阻止或减少T-2毒素进入脑组织,从而缓解T-2毒素的神经毒性。