寄生性原虫影响宿主上皮细胞凋亡研究进展

吴善博,邵天人,张雅芳,李娟锋,孙露露,边啸坤,王荣军

(河南农业大学动物医学院,河南郑州 450046)

细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡,对维持细胞内环境稳态至关重要[1]。凋亡的发生是信号分子通过多种信号通路将信息传递至细胞内,激活关键信号靶点从而诱导细胞凋亡[2]。细胞凋亡途径主要包括死亡受体介导的外源性途径、线粒体介导的内源性途径、颗粒酶/穿孔素介导的途径以及内质网应激介导的途径[3]。凋亡途径涉及一系列基因的激活、表达及调控,如半胱氨酸蛋白酶(caspase)、凋亡抑制蛋白(IAPs)的激活,microRNAs、Bcl-2家族基因的表达调控等,最终使细胞发生凋亡[4-6]。

研究表明,肠道寄生性原虫可诱导宿主上皮细胞发生凋亡,如隐孢子虫(Cryptosporidium)感染诱导人胆管上皮细胞(H69)发生凋亡;十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis)诱导人回盲肠癌细胞(HCT-8)发生凋亡;芽囊原虫(Blastocystis)感染诱导大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)凋亡等[7-9]。隐孢子虫、十二指肠贾第虫和芽囊原虫等肠道寄生性原虫通过诱导或抑制宿主上皮细胞凋亡,从而达到利于自身发育的目的,可见寄生虫的生长、发育、感染与宿主细胞凋亡有着重要联系[10-12]。寄生性原虫感染宿主肠道时,其肠道屏障被破坏导致肠道稳态紊乱,这时机体可通过调节凋亡机制以维持肠道稳态平衡,而这种稳态平衡更是寄生虫-宿主相互作用的结果[12-13]。为进一步探索凋亡机制在寄生虫-宿主间的作用,论文主要对隐孢子虫、十二指肠贾第虫和芽囊原虫诱导上皮细胞凋亡机制做一综述。

1 隐孢子虫

隐孢子虫是全球分布的重要人畜共患原虫,寄生于人和多种动物的胃肠道上皮细胞中。目前已发现47个有效种,感染人类的虫种约20个,其中以微小隐孢子虫(C.parvum)、人隐孢子虫(C.hominis)最为常见[14-16]。微小隐孢子虫可通过改变关键紧密连接和黏附连接蛋白的表达来破坏肠上皮屏障功能,引起宿主腹泻[17]。

隐孢子虫主要通过死亡受体/配体(Fas/FasL)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导受体/配体(TRAI/TRAIL)途径调控宿主上皮细胞凋亡[7,18-19]。将微小隐孢子虫感染的H69细胞和未感染的Fas敏感的人T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat E6-1)共培养24 h,Jurkat E6-1细胞凋亡率增加,免疫细胞化学技术和共聚焦显微镜检测表明微小隐孢子虫增加FasL的迁移率,诱导其裂解为可溶性FasL,而通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抑制剂与Fas/FasL中和抗体的作用可抑制该凋亡途径,表明微小隐孢子感染可以依赖Fas/FasL途径的自分泌和旁分泌方式诱导H69细胞发生凋亡[7]。另一研究显示,微小隐孢子虫感染HCT-8细胞后使护骨素(OPG)表达上调,通过不同浓度TRAIL和OPG重组蛋白处理细胞可阻断TRAIL途径诱导的凋亡并减少虫体感染量[18]。

PI3K/AKT信号通路和NF-κB信号通路调控微小隐孢子虫诱导宿主上皮细胞凋亡。微小隐孢子虫更易感染营养不良的C57BL/6小鼠,且被感染小鼠体重明显下降;caspase-3蛋白表达量降低,对caspase-3蛋白免疫染色,表明凋亡细胞发生于肠绒毛顶端;微小隐孢子虫感染营养不良小鼠后,可激活PI3K/AKT信号通路,从而抑制caspase-3活性和细胞凋亡,进而增加宿主感染负荷[20]。微小隐孢子虫感染细胞激活NF-κB系统,并且伴随白介素-8(IF-8)的分泌;而抑制剂MG-132和SN50可抑制NF-κB与DNA结合和降低IF-8的分泌,但显著促进了微小隐孢子虫诱导H69细胞凋亡;结果表明微小隐孢子虫诱导细胞凋亡受NF-κB的影响,当NF-κB被抑制时,微小隐孢子虫诱导细胞凋亡能力增加[21]。文献[19]研究结果与此一致,微小隐孢子虫通过抑制NF-κB进一步增加肠上皮细胞凋亡,将微小隐孢子虫体外感染HCT-8细胞,并加入诱导凋亡药物进行试验,微小隐孢子虫显著降低了这些药物诱导的细胞凋亡作用,表明隐孢子虫可减弱促凋亡因子诱导凋亡的作用,以利于自身的增殖发育。

Bcl-2基因家族、Survivin基因、及microRNAs等参与调控微小隐孢子虫感染诱导的宿主上皮细胞凋亡。隐孢子虫在感染HCT-8细胞早期(6～12 h)抗凋亡基因表达上调,促凋亡基因表达下调;感染后期(24～72 h)促凋亡基因表达上调,抗凋亡基因表达下调;而沉默Bcl-2基因后,细胞凋亡增加,表明Bcl-2基因家族调控微小隐孢子虫感染诱导的宿主上皮细胞凋亡[22]。另一研究表明,微小隐孢子虫体外感染HCT-8细胞可诱导抗凋亡蛋白家族基因Survivin表达上调,从而抑制caspase-3、caspase-7活性,使细胞凋亡减弱;但沉默Survivin表达后,细胞凋亡又明显增加,虫体数量减少;表明微小隐孢子虫感染期间可通过调节Survivin表达,以抑制细胞凋亡促进虫体自身发育[23]。

微小隐孢子虫感染H69细胞后通过下调miR-513表达从而促进程序性死亡配体-1(B7-H1)表达;与微小隐孢子虫感染的H69细胞共培养的Jurkat细胞凋亡率明显增加;使用B7-H1中和抗体或转染miR-513过表达前体后Jurkat细胞凋亡被部分阻断,表明miR-513介导B7-H1的表达参与调控隐孢子虫感染上皮细胞凋亡[24]。微小隐孢子感染细胞后通过miR-942-5p靶向调控干扰素诱导蛋白27(IFI27)的表达进而通过TRAIL途径影响细胞凋亡,从而调控微小隐孢子虫的内生发育;即感染前期下调IFI27的表达量,抑制细胞凋亡进而促进虫体发育;后期上调IFI27的表达量,促进细胞凋亡而抑制虫体发育[25]。Wang等[26]研究微小隐孢子虫感染早期HCT-8细胞发现一些microRNA表达水平发生显著变化,功能预测分析结果显示Hsa-miR-18b-3p、Hsa-miR-3976等与细胞凋亡也有一定的联系,这对为进一步研究microRNAs调控隐孢子虫感染诱导细胞凋亡的机制提供新理论基础。

2 十二指肠贾第虫

十二指肠贾第虫是寄生于人和多种动物十二指肠内的一种机会性致病原虫。该虫具有A-H共8种集聚体,其中A和B被认为是人兽共患集聚体,可感染人和多种哺乳动物;集聚体C和D常见于犬科动物,而集聚体E在蹄类动物中最为常见[16,27]。生活史仅有滋养体和包囊两个阶段,包囊可长期在环境中生存,使十二指肠贾第虫在宿主间的传播更为广泛,从而增加了人类食源性和水源性感染的风险,感染者主要表现为腹泻、腹痛、腹胀等临床症状[28-29]。

研究表明,十二指肠贾第虫感染引起肠上皮细胞紧密连接蛋白Claudin 1表达下调,进而导致肠上皮屏障功能障碍,引起吸收不良和慢性腹泻,并诱导肠上皮细胞凋亡[30]。将虫体与一种新型未转化的人十二指肠上皮(SCBN)细胞共培养,结果表明贾第虫以依赖caspase方式增加细胞膜通透性,同时破坏胞质紧密黏连蛋白ZO-1,并诱导肠上皮细胞发生凋亡[31]。十二指肠贾第虫感染HCT-8细胞可诱导Bax表达上调、Bcl-2表达下调,并激活内、外两种途径依赖于caspase级联反应诱导细胞凋亡[8]。

肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)信号通路调控十二指肠贾第虫诱导的上皮细胞外源性凋亡。十二指肠贾第虫滋养体与人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)共培养可降低Caco-2细胞活性;通过高通量测序技术(RNA-seq)分析表明,一些凋亡相关基因和去泛素酶基因的表达发生了显著性变化,而滋养体感染Caco-2细胞后可通过上调肿瘤抑制因子(CYLD)表达,进而激活TNFR1通路和受体相关蛋白(RIP1)的K63泛素化,从而激活caspase-3和caspase-8信号通路,诱导Caco-2细胞发生外源性凋亡[32]。

十二指肠贾第虫可通过活性氧介导上皮细胞发生线粒体内源性凋亡。在体外将十二指肠贾第虫WB虫株和Caco-2细胞共培养,通过荧光显微镜、透射电镜、流式细胞仪和Western blot等技术对细胞凋亡水平进行检测,结果表明十二指肠贾第虫滋养体通过刺激细胞产生活性氧(ROS),并通过调节细胞内相关凋亡因子Bax和Bcl-2的表达,引起线粒体外膜通透性增加,线粒体膜电位(MMP)下降和细胞色素C(Cyt-C)的释放;从而激活caspase-9和caspase-3,促使DNA修复酶(PARP)裂解,最终引起线粒体介导的内源性凋亡[33]。

环氧化酶-2(COX-2)作为抗凋亡启动子并激发潜在因子调控十二指肠贾第虫感染诱导的肠上皮细胞凋亡。研究表明,十二指肠贾第虫体外感染肠上皮细胞后通过抑制COX-2活性从而降低细胞活性;增加ROS生成并减少NO的释放,促进caspase-3激活和PARP裂解,抑制Survivin等抗凋亡蛋白的表达从而促进IEC细胞凋亡,而COX-2过表达则抑制IEC细胞凋亡;进一步研究表明,p38/ERK/AKT/NF-κB信号通路可调控十二指肠贾第虫感染过程中COX-2介导的ROS和NO生成和抗上皮细胞凋亡作用,并且COX-2介导的抗上皮细胞凋亡作用与Toll样受体4(TLR4)依赖的p38-NF-κB信号通路激活有关[34]。

十二指肠贾第虫不同虫株诱导宿主上皮细胞凋亡水平存在差异。Chin等[31]使用贾第虫NF、S2、WB和PB虫株分别感染十二指肠上皮细胞并加入Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK),其中NF和S2虫株可诱导细胞凋亡,而WB和PB虫株未诱导细胞凋亡,表明不同虫株诱导胃肠道上皮细胞凋亡能力有所不同,此结果与新生大鼠感染十二指肠贾第虫引起小肠损伤具有虫株依赖性的研究结果一致[35]。贾第虫感染不局限于诱导细胞凋亡,还会引起一些促炎症因子的释放,甚至改变肠上皮细胞基因表达的变化等[36]。

3 芽囊原虫

芽囊原虫是一种寄生于人和动物肠道的厌氧性单细胞原生生物,其形态结构较复杂,可分为包囊型、空泡型、颗粒型等形态,但目前对该虫生活史了解尚不明确[37-38]。芽囊原虫可与其他寄生虫共感染,如隐孢子虫、贾第虫和阿米巴原虫等;其感染与其他疾病的发生有一定联系,如肺结核、艾滋病和其他慢性疾病等[39]。尽管目前对芽囊原虫的生物学、遗传多样性和流行病学有了一定的认识,但其致病力仍存在争议。有关芽囊原虫在体内外的研究表明,其不仅能引起肠道紧密连接蛋白的降解和肠道膜通透性的改变,还能诱导细胞炎性因子的释放、以及肠道细胞的凋亡等[40-42]。

芽囊原虫感染引起大鼠肠上皮通透性增加,并诱导肠上皮细胞凋亡从而破坏肠屏障功能[43]。研究证明,鼠源芽囊原虫WR1虫株以非接触方式诱导IEC-6细胞凋亡[9],并且重新排列纤维状肌动蛋白(F-actin)的分布、降低上皮间电阻并增加上皮通透性。值得注意的是,该研究显示抗原虫药物甲硝唑可消除鼠源芽囊原虫WR1虫株对上皮屏障功能作用的影响,表明该药物对芽囊原虫引起的肠道疾病具有一定的治疗潜力[9]。

芽囊原虫感染小鼠进行体内试验,与未感染组相比,感染组小鼠肠道细胞乳糖酶活性降低;免疫组化试验表明感染组小鼠肠道细胞炎症细胞因子TNF-α水平降低、Bax表达上调,Bcl-2表达下调,结果表明芽囊原虫通过TNF-α相关途径诱导小肠上皮细胞凋亡,从而降低乳糖酶活性[44]。

芽囊原虫不同虫株诱导宿主上皮细胞凋亡的能力有所差异。用分离出的不同亚型芽囊原虫株(ST4和ST7)与Caco-2细胞共同培养[45],用流式细胞术检测Caco-2细胞早期凋亡的变化,免疫组化技术和共聚焦显微镜观察芽囊原虫感染Caco-2细胞不同时期ZO-1连接蛋白的重组情况,以及用蛋白印迹法对相应凋亡蛋白分子检测,结果表明ST7虫株可激活caspases-3和caspase-9,而未激活caspases-8,并引起上皮间电阻、上皮通透性和紧密连接蛋白ZO-1分布的改变,用caspases抑制剂Z-VAD-FMK处理后检测发现,可显著性抑制以上变化,结果表明芽囊原虫诱导上皮细胞凋亡,并且引起细胞屏障的改变[45]。ST7虫株可诱导Caco-2细胞凋亡,而ST4虫株不可以,表明芽囊原虫在致病性方面表现出宿主特异性和虫株间的差异[46]。深入研究芽囊原虫感染宿主期间诱导细胞凋亡的机制和与宿主间的相互作用关系,对研发该病原引起的肠道性疾病的治疗药物具有一定的作用。

4 展望

寄生性原虫诱导宿主上皮细胞凋亡是寄生虫与宿主共进化过程中形成的重要调控机制之一,影响寄生虫在宿主体内的发育以及疾病的发展过程。绝大数寄生性原虫调控宿主细胞凋亡机制尚不清楚,一些关键技术性问题限制了凋亡机制的相关研究,如隐孢子虫等一些寄生性原虫未有稳定的动物感染模型,对隐孢子虫进行遗传操作尚存在一定的困难。因此,未来在解决技术瓶颈基础上,利用体内外试验探索寄生性原虫感染诱导宿主细胞凋亡的调控机制,揭示参与调控细胞凋亡的一些关键蛋白分子的作用机制以及宿主非编码RNA的调控机制,为设计开发抗寄生虫性原虫病药物和疫苗等提供新策略。