猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白和非结构蛋白研究进展

陈 旭,汤德元,曾智勇,王 彬,陈阊峥,罗 柳,袁盛林,廖正波

(贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)为动脉病毒科囊膜病毒家族,是一种有囊膜病毒粒子呈球型单股正链RNA病毒,PRRSV基因组全长约15 kb,包含10个以上开放阅读框,可编码参与病毒复制和转录的NSP1α、NSP1β、NSP2等至少12种非结构蛋白及GP5、M、N等8种结构蛋白。20世纪90年代初在欧洲和北美几乎同时出现PRRSV,但两种毒株基因组序列同源性只有约60%,因此PRRSV基因型被分为欧洲型(PRRSV-1)和北美型(PRRSV-2)。PRRSV感染猪群可引起以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的急性、高度传染性疫病,给养猪业带来严重危害。妊娠母猪染病后主要表现为繁殖障碍,妊娠前期的母猪流产,妊娠中期的母猪产下死胎、木乃伊胎、弱胎、畸形胎,哺乳母猪产后无乳。公猪感染后表现为性欲减弱、精液质量下降、射精量少等症状。仔猪染病后表现为呼吸困难,关节肿大,败血症等[1]。PRRSV主要感染猪单核细胞/巨噬细胞,如猪肺泡巨噬细胞(PAMs)和树突状细胞(DC),病毒在增殖过程中利用宿主细胞的物质合成自身结构蛋白、非结构蛋白及核酸,但成熟的病毒颗粒中只含有结构蛋白及核酸,非结构蛋白则与宿主受体结合参与病毒的转录和复制。PRRSV因其自身基因组特性及各种内外因素的影响,一直处于持续不断的变异中,临床呈现多毒株并存的局面,增加了疾病的防控难度,文章对从多个方面对PRRSV结构蛋白和非结构蛋白进行阐述,以期能对PRRSV作进一步的研究并制定防控PRRS的策略。

1 结构蛋白

目前已知的PRRSV结构蛋白由核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M)、包膜蛋白(E)和5种糖蛋白构成,PRRSV的ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6、ORF7开放阅读框分别编码这些结构蛋白。其中ORF5a存在于ORF4和ORF5之间,编码GP5a 囊膜糖蛋白,ORF2a编码GP2a蛋白,ORF2b编码E蛋白,ORF3编码GP3蛋白,ORF4编码GP4蛋白,ORF5编码GP5蛋白,ORF6编码M蛋白,ORF7编码N蛋白,这些结构蛋白与宿主细胞内特定细胞因子相互作用并介导PRRSV侵入易感细胞。

糖蛋白是病毒主要的表面抗原,它们与细胞受体相互作用触发病毒感染,有些还介导病毒侵入宿主细胞。并且它还具有重要的受体结合位点和抗原表位,是疫苗研究的热点,有研究表明,针对GP2a上B细胞表位的抗体可以抑制猪肺泡巨噬细胞(PAM)中的PRRSV复制[2]。宿主细胞表面的CD163蛋白具有介导病原体的内吞的作用,有研究开发了针对PAM CD163受体的单克隆抗体(mAb),使GP2a不能与CD163结合,从而部分阻断PRRSV进入细胞,表明PRRSV GP2a在介导PRRSV进入易感宿主细胞时具有积极作用[3]。E蛋白是一种离子通道包膜蛋白,一方面E蛋白与α微管蛋白(α-tubulin)相互作用使微管解开,损坏细胞膜完成性,促进病毒进入细胞[4],另一方面E蛋白参与降低宿主细胞中的ATP水平,胞内低浓度ATP激活了半胱天冬酶-3(caspase-3)进而触发细胞凋亡,在细胞水平上抵御病毒感染[5]。GP3蛋白与GP2a一样能促进病毒进入细胞,缺失GP3蛋白的病毒颗粒不具有传染性。GP4蛋白少量存在于PRRSV表面,具有高度可变性,能够被宿主细胞的抗体识别诱发免疫反应。研究发现,GP4蛋白中抗体识别表位的氨基酸发生突变可以消除抗体识别,表明PRRSV通过操控GP4蛋白发生变异从而逃避宿主细胞的免疫检测[6]。GP4的另一功能是与GP2a蛋白特异性结合作为PRRSV的附着蛋白,进而与CD163的相互作用,使病毒进入易感宿主细胞。GP5蛋白对于PRRSV在易感细胞内复制和组装是不可或缺的,它参与病毒与宿主受体结合的过程。研究发现PRRSV GP5将宿主细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)限制在细胞质中,并利用其糖酵解活性促进PRRSV复制[7]。非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9)在细胞迁移和黏附中发挥重要作用,GP5蛋白与MYH9 C端结构域相互作用,使PRRSV病毒粒子被MYH9捕获,促进病毒进入宿主细胞[8]。

M蛋白是PRRSV中最保守的膜基质蛋白且具有很强的抗原性,因此M蛋白也成为研发新型亚单位疫苗的候选蛋白。M蛋白不含已知的信号肽,它需要与GP5蛋白结合成二聚体,PRRSV依靠GP5/M复合体与硫酸肝素(HS)相互作用,才能有效黏附在细胞表面。M蛋白与位于细胞器及囊泡膜上的跨膜蛋白相互作用,用其在细胞内运输和膜融合中的作用促进病毒粒子的移动[9]。

核衣壳(N)蛋白是一种多磷酸化蛋白,N蛋白合成后先磷酸化,再运送到细胞核,在整个病毒生命周期中表现出多种功能。N蛋白的基本功能是形成病毒衣壳以包装病毒基因组。在N蛋白78 aa的丝氨酸突变为丙氨酸后可以下调病毒基因组和亚基因组RNA的转录水平,说明N蛋白突变可以显着降低病毒在体外的复制效率[10]。N蛋白同时与宿主细胞的细胞质和细胞核上受体结合,并与许多宿主因子相互作用,影响病毒致病基因表达。N蛋白1-15aa区间是一个新的B细胞表位,宿主细胞产生的抗体可以与此抗原表位结合,从而抑制PRRSV在体内的复制[11]。

2 非结构蛋白

PRRSV的非结构蛋白由开放阅读框ORF1编码,包括ORF1a和ORF1b,它们分别编码多聚蛋白pp1a和pp1ab。其中pp1a裂解成9个非结构蛋白NSP1a、NSP1β和NSP2-NSP8,pp1ab裂解成4个非结构蛋白NSP9、NSP10、NSP11、NSP12,这些非结构蛋白在病毒基因组的复制、转录和拮抗干扰素等过程中发挥重要作用。

NSP1蛋白是PRRSV感染期间合成的第1个病毒蛋白,编码NSP1的基因序列高度保守,NSP1参与病毒基因组的复制和亚基因组mRNA的转录。NSP1蛋白被自身的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)切割成NSP1α和NSP1β两个亚基。Nsp1α的锌指(ZF)结构域刺激白细胞分化抗原83(CD83)启动子的分泌,CD83抑制了树突状细胞(MoDC)呈递抗原并激活免疫应答的能力,造成宿主细胞的免疫抑制[12]。为进一步探索NSP1对宿主炎症反应的影响,发现NSP1β蛋白可激活NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)介导的炎症反应抵御病毒侵染,NLRP3是细胞质内重要的模式识别受体,参与炎性粒子组装,激活炎症信号通路,介导炎症反应的发生和发展,相反,NSP1ɑ蛋白则抑制NLRP3炎症小体活化,下调炎症反应的发生,表明NSP1在促进或抑制机体炎症反应方面也发挥作用[13]。NSP2蛋白是PRRSV中分子量最大的非结构蛋白,同时也是变异最大的非结构蛋白,其中N端木瓜样蛋白酶(PL2)结构域具有去泛素化和拮抗干扰素功能,并抑制干扰素刺激基因15(ISG15)的抗病毒功能以阻断先天性抗病毒反应,中心性高变(HV)结构域是PRRSV感染PAM的重要驱动因子,并有助于宿主产生抗体的识别,C端跨膜区(TM)结构域能够抑制细胞蛋白翻译。PRRSV NSP2TF能显著下调猪白细胞抗原I类(SLA-I)在感染宿主细胞中的表达,SLA-I是激活CD8+T细胞进行抗原呈递的重要因子,下调SLA-I表达意味着抑制宿主免疫应答,从而上调病毒感染能力[14]。NSP3、NSP5是内质网(ER)跨膜蛋白酶,它们诱导PRRSV在易感细胞内形成自噬体,成熟的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,然后降解自噬体内容物,最后降解的物质被释放到细胞质中,转化为氨基酸和能量完成细胞质内代谢过程[15]。此外,NSP5还可作为Janus激酶/转录活化因子3(JAK/STAT3)通路的抑制因子,影响下游基因的转录、促炎细胞增殖、分化、凋亡过程以及先天免疫应答[16]。NSP4是一种3C样丝氨酸蛋白酶(3CLSP),负责大多数非结构蛋白的加工。此外,NSP4与感染细胞内其他成分相互作用,以维持PRRSV在感染细胞内的复制存活。研究发现,NSP4激活促凋亡蛋白(Bim)表达使感染细胞凋亡,被释放出来病毒再感染其他易感细胞,加重宿主感染[17]。猪mRNA脱帽酶1a(pDCP1a)能刺激IFN分泌,PRRSV NSP4可以下调pDCP1a表达,抑制宿主细胞对PRRSV的防御[18]。PRRSV NSP6作用于宿主信号通路,并调控宿主炎症反应的发生。黏膜相关淋巴瘤易位基因1(MALT1)是活化NF-κB的信号转导通路中的重要信号分子,NSP6在转染后24 h可通过泛素化-蛋白酶体途径抑制MALT1编码蛋白的表达,进而抑制NF-κB信号分子激活,降低下游促炎细胞因子的表达,部分阻断炎症反应的发生[19]。PRRSV NSP7由基因组中相对保守的区域编码,具有较强的免疫原性,目前,对它研究的相关报道较少,但可以确定的是它确实影响病毒的复制周期,而具体作用机制仍有待探究。NSP8是NSP9的N末端延伸,因此NSP8的功能可能与NSP9的功能有很大关联[20]。

PRRSV NSP9是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),参与形成病毒的复制和转录复合物(RTC)。宿主细胞的其他蛋白能够与NSP9蛋白相互作用,对病毒复制产生负性调控作用。CCCH型锌指抗病毒蛋白(ZAP)能抑制PRRSV早期复制,有研究提出ZAP与NSP9相互作用进而发挥抑制作用[21]。核苷酸结合寡聚结构域样受体X1(NLRX1)是参与免疫防御和炎症反应的关键介质,NSP9与NLRX1相互作用来抑制PRRSV的复制[22]。PRRSV解旋酶(NSP10)是具有易位和解旋活性的多功能蛋白,对病毒RNA合成起着至关重要的作用。有研究针对PRRSV NSP10设计单克隆抗体(mAb 4D9)用来区分PRRSV-1和PRRSV-2,试验表明mAb 4D9可以识别PRRSV-2 NSP10,但不能识别PRRSV-1 NSP10,表明NSP10可作为PRRSV-2的标志性蛋白,以便宿主细胞产生的抗体与之结合发挥免疫效应[23]。NSP11具有核糖核酸内切酶活性,对于病毒基因组复制和亚基因组的合成是必需的。此外,NSP11的过度表达可以提高PRRSV的滴度,具有抑制受感染宿主先天免疫系统等功能[24]。宿主p21基因编码的内源性蛋白能抑制PRRSV复制,PRRSV感染后NSP11可引起p21降解并促进病毒在MARC-145细胞中的复制[25],PRRSV 感染后NSP11被宿主细胞干扰素调节因子9(IRF9)识别并被抑制表达,同时激活转录因子复合物IFN刺激基因因子3(ISGF3)的形成和核易位,从而阻断IFN-I信号传导以拮抗宿主先天性抗病毒反应[26]。PRRSV NSP12参与PRRSV亚基因组mRNA(sgmRNA)的合成,若是NSP12中35位与79位半胱氨酸发生联合突变则影响NSP12参与病毒sgmRNA的合成[27]。此外,PRRSV NSP12通过调节细胞因子参与病毒感染,RING指蛋白114(RNF114)可作为PRRSV复制的抑制因子,RNF114通过介导NSP12的K27多聚泛素化修饰,促进NSP12经蛋白酶体途径降解,使病毒复制受到抑制[28]。核细胞素α 6(KPNA6)的降解不利于PRRSV复制,PRRSV感染后NSP12阻断了KPNA6的泛素-蛋白酶体降解,使KPNA6的半衰期延长,为宿主细胞中PRRSV复制提供保障[29]。

3 PRRSV结构蛋白和非结构蛋白对宿主信号通路的影响

为了在宿主细胞中成功存活并持续性感染,PRRSV利用复杂的信号通路抑制或逃避宿主的先天性和适应性免疫系统,并改变宿主某些基因表达从而更好的实现病毒侵入的过程。PRRSV感染其结构蛋白与非结构蛋白能够激活许多信号通路,触发下游的趋化因子、转录因子和炎性细胞因子的激活,以调节病毒的复制和增殖,例如抑制炎症细胞因子的表达,调节白细胞介素-10(IL-10)的生成以抑制免疫反应;干扰免疫细胞的功能,抑制IFN-Ⅰ的生成,最终导致受感染者出现病毒血症和持续感染。

属于丝裂原活化蛋白激酶家族的细胞外信号调节激酶(ERK)介导PRRSV感染期间炎症反应的发生。研究表明,PRRSV-2 NSP1能够阻断ERK信号传导,下调ERK下游转录因子血清核转录因子激活蛋白-1(AP-1),进一步抑制能增加促炎细胞因子产生的细胞通信网络因子1和结缔组织生长因子2(ccn1和ccn2)的转录,抑制宿主的炎症反应的发生[30]。免疫系统中淋巴细胞的生长和分化依赖于细胞因子,酪氨酸蛋白激酶(JAK)/ 转录激活因子(STAT)信号通路激活多数细胞因子以发挥免疫学效应,IFN通过激活JAK/STAT信号通路诱导多种基因的表达,在宿主抗病毒反应中起着至关重要的作用,而STAT2在JAK/ STAT信号传导中是必不可少的。研究发现NSP11的N端域负责诱导STAT2降解,从而拮抗干扰素诱导其下游信号传导的发生,抑制宿主的先天免疫反应。另外,STAT3蛋白在细胞生长,增殖,分化,免疫和炎症反应中起着关键作用,研究发现,PRRSV感染会导致宿主细胞中STAT3蛋白表达水平显着降低,PRRSV NSP5通过提高STAT3多泛素化水平并将其半衰期从24 h缩短到3.5 h来加速STAT3降解,导致免疫细胞因子和炎症因子被抑制,从而实现病毒在宿主细胞中复制和传播[31]。CD83是树突状细胞(DC)分泌的可负反馈调节DC免疫功能的细胞因子,因此CD83是一种抗炎和免疫抑制介质,研究发现PRRSV NSP10和E蛋白通过核因子kappa B(NF-κB)和特异性糖蛋白1(Sp1)信号通路强烈刺激DC中的CD83的表达,进而造成宿主免疫抑制,利于病毒的存活[32]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是单核细胞分泌的一种促炎细胞因子,可被蛋白激酶C(PKC)活化,PRRSV E蛋白可激活 PKCδ,促进机体炎症反应的发生[33]。PRRSV N蛋白被发现能够通过NF-κB和p38 MAPK途径参与上调IL-10的表达,使免疫细胞介导的抗原呈递和免疫反应受到抑制,对感染机体内的PRRSV起到保护作用[34]。近年来,高致病性猪蓝耳病受到广泛关注,猪感染了高致病性蓝耳病病毒(HP-PRRSV)后发生高热,有研究提出这是因为机体产生的前列腺素E2(PGE2)增加从而使猪发生高热,而PGE2的产生与环氧合酶2(COX-2)的表达密切相关。NSP2与14-3-3蛋白(GRF)家族相互作用激活细胞外调节激酶1(MEK1)-ERK1/2-CAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)信号通路以增强COX-2表达,从而促进PGE2的产生,使患病猪发生高热[35]。无论是PRRSV的结构蛋白还是非结构蛋白,都能影响宿主信号传导,对宿主免疫机制发挥正性或负性调控作用。

4 PRRSV结构蛋白和非结构蛋白检测技术

PRRSV感染的猪康复后可长期带毒,且不定期排毒,若引种了带毒猪可导致PRRSV在猪群中的传播和流行,因此必须加强引种猪的快速筛查,避免引进阳性猪造成PRRSV的扩大和流行。当前商品化疫苗对PRRSV的预防作用有限,仍需通过生物安全措施进行防控,早期检测,及时淘汰阳性猪,降低规模化猪场感染PRRSV的几率。近年来,以PRRSV结构蛋白和非结构蛋白作为抗原开发的检测方法层出不穷,其中报道最多的当属核衣壳蛋白(N)作为标记抗原以此来检测PRRSV特异性抗体。

N蛋白是构成PRRSV病毒粒子的3种主要结构蛋白之一,具有强抗原性,是诊断或监测机体产生病毒特异性抗体的合适靶标。猪感染PRRSV后最早产生的是针对N蛋白的抗体,有研究建立一种基于N 蛋白的间接ELISA 方法,该方法与美国赛默飞世尔科技ELISA试剂盒相比,其特异性和灵敏度分别为 76.18%和82.61%,可用于大型血清学调查[36]。20世纪80年代开发的免疫层析试纸(ICST),因其简单易行、操作快捷、成本低廉等优点,已被用于各种动物疾病的快速监测。有研究开发一种以胶体金纳米颗粒标记的PRRSV-1和PRRSV-2 N蛋白作为捕获抗原,在PRRSV感染早期检测机体中PRRSV特异性抗体的ICST检测方法,该方法用两种类型的N蛋白作为抗原可提高PRRSV的诊断性能[37]。基于乳胶微球的ICS测试,用乳胶微球标记的PRRSV N蛋白特异性单克隆抗体作为标记探针,检测宿主体内PRRSV病毒粒子,可用于在现场进行PRRSV的快速诊断[38]。除了用结构蛋白N作为标记抗原建立的检测方法外,用PRRSV非结构蛋白NSP1α开发了一种基于荧光素酶连接的抗体捕获测定(LACA),将NSP1α与Rellina荧光素酶底物结合并转入基因克隆的质粒中,将质粒转染到T细胞中进行瞬时表达后裂解细胞,将细胞裂解物与猪血清形成的抗原-抗体复合物加入包被有蛋白质G的微孔板上,通过测量荧光亮度值,检测PRRSV特异性抗体,开发了一种荧光素酶免疫沉淀系统,用于快速检测临床样品是否被PRRSV感染[39]。

5 小结

PRRSV结构蛋白主要作用在于与宿主膜蛋白互作,其中GP2a、E、GP3、GP4参与病毒进入细胞的过程;GP5不仅参与病毒侵入细胞还促进对病毒的复制;M蛋白则参与病毒粒子的移动,将病毒粒子从内质网运输到高尔基体,参与病毒释放;N蛋白与宿主细胞因子结合调控病毒的复制和宿主炎症反应。PRRSV非结构蛋白主要影响病毒的复制,其中NSP1、NSP4、NSP11通过与宿主细胞因子相互作用抑制细胞内IFN-I的产生,下调宿主炎症反应的发生;NSP2能抑制ISG15的抗病毒功能;NSP9和NSP10都作为病毒感染后宿主识别的靶标,参与抑制PRRSV在细胞内复制,另外NSP11与NSP12与宿主细胞因子作用,抑制免疫反应促进病毒复制,然而NSP12通过阻断KPNA6降解过程对病毒复制产生抑制作用,因此这些非结构蛋白的存在对病毒的复制增殖并不是绝对有利的。此外,PRRSV某些结构蛋白和非结构蛋白作用于宿主信号通路,同样能对病毒感染产生影响。如ERK-Ap-1信号通路、JAK/STAT信号通路、MEK1-ERK1/2-C/EBPβ信号通路。PRRSV 的N蛋白、NSP1α蛋白、NSP7蛋白也作为特异性抗原被用来检测PRRSV特异性抗体,开发了以ELISA、免疫层析检测为代表的检测方法,为实现临床疑似PRRSV感染猪的样品鉴定及提前防控提供参考方法。随着分子生物学和分子免疫学的飞速发展,我们需要对PRRSV的基因组结构及其编码的蛋白有更加全面的认识,了解PRRSV的免疫机制,研制更有效安全的疫苗仍是防控PRRS的主要目标。