实时荧光PCR 法鉴别莜面中掺杂淀粉的植物源性

陈佳琛，陈 晨，张 瑞，彭瑛琪，贺丽霞，狄 慧*

（1.张家口市食品药品检验中心，河北张家口 075000；2.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北石家庄 050071）

裸燕麦（Avena nudaL.）亦称莜麦，禾本科燕麦属一年生草本植物[1]，种植于华北和西北等半干旱地区，是北方高寒地区的主要粮食作物[2]。莜麦成熟后稃革会与里边的种子分离，种子磨成面粉即为莜面[3]。

莜面营养价值很高，含18 种氨基酸，且比例均衡[4]。莜面富含木质素、纤维素、半纤维素和β-葡聚糖等膳食纤维，其中约三分之一为水溶性膳食纤维，具有良好的保健功效[5]。此外，莜面中还含有丰富的钙、锌、硒等矿物质和微量元素[6]。

随着人们对莜面营养价值，特别是保健功能认识的提高，莜面加工及餐饮产业实现了快速发展，涌现出如“西贝莜面”“绿坝”“谷麦郎”“北燕”等诸多知名餐饮及特色农产品品牌。优质的莜面口感纯香，深受人们喜欢，优质莜面的市场需求呈不断增长趋势。但由于莜麦种植的产业化程度不高，加之生长环境条件有限，优质莜面产量增长缓慢。受利益驱使，不良商家往往在劣质莜面中掺入其他植物源性淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉等来改变劣质莜面的口感，达到以次充好、以高品质售卖的目的[7]。

实时荧光PCR 法灵敏度高，特异性强，同时植物基因组DNA 有很好的稳定性和种属特异性，少量DNA 经PCR 扩增分析就可检测其植物源性[8]。基于种属特异性基因组DNA 的实时荧光PCR 法，是食品植物源性鉴别的重要技术方法，如玛咖[9]、樱桃[10]等植物源性可以通过分子生物学方法对其进行鉴别。

基于此，利用红薯、马铃薯、玉米、木薯来源的食用淀粉和莜面在种属基因组DNA 间的特异性差异，建立实时荧光PCR 检测方法，对莜面掺杂植物源性淀粉的情况进行有效鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

（1）原料。莜麦、小麦、荞麦、玉米、薏仁米、小米、高粱、马铃薯、木薯、红薯10 种原料及20 种市售莜面，均购自超市。

（2）绝对灵敏度分析样品。对莜麦、红薯、玉米、马铃薯、木薯原料分别提取DNA，用于绝对灵敏度分析。

（3）相对灵敏度分析样品。莜面中分别掺入自制红薯、玉米、马铃薯、木薯淀粉制成不同质量分数比例的掺假模型并提取DNA，用于相对灵敏度分析。

（4）自制淀粉过程。马铃薯切块打浆，浆液与渣一起倒入纱布袋中，水洗后收集滤液。边倒浆液边水洗，至渣中浆液洗净。滤液冷藏静置，每日搅动2 ～3 次。待沉淀，将上清液及残渣弃去，取中间粉浆加水，沉淀后弃去清液。反复多次，沉淀晾干后得到粗制马铃薯淀粉。同法制得木薯淀粉、红薯淀粉、玉米淀粉[11]。

（5）材料。DNA 提取试剂盒（货号：DP302），天根生化科技有限公司；Real Time PCR Mix（Taqman）试剂盒，北京美正生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BioSpectrometer basic 核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf 公司）；Fresco 21 冷冻高速离心机（美国Thermo 公司）；QuantStudio 7 Flex 实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo 公司）。

1.3 引物及探针

真核生物、莜麦引物探针出自文献，马铃薯、玉米、红薯、木薯特异性引物探针来自自行设计。所用引物探针均由上海生工合成（见表1）。

1.4 试验方法

1.4.1 基因组DNA 提取及有效性判定

采用深加工食品DNA 提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。提取完成后，使用蛋白核酸测定仪检测DNA 溶液的浓度及纯度来判定DNA 提取效果。PCR 反应中，通过18S rRNA 真核生物内参基因的是否扩增来判定提取的植物组DNA 溶液的PCR扩增有效性，防止假阴性结果。

1.4.2 DNA 浓度和纯度测定

使用蛋白核酸测定仪检测DNA 溶液浓度及纯度，DNA 溶液浓度在5 ng·μL-1以上，A260／A280为1.7 ～1.9。

1.4.3 实时荧光PCR 扩增及有效性判定

体 系：预 混 合 液12.5 μL；探 针（10 μmol·L-1）1 μL；上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL；DNA 模板5 μL，无菌水补至总体系25 μL。

条件：预变性95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃60 s，40 个循环。

试验对照：用含目标成分的样品提取的DNA为阳性对照，以不含目标成分的样品DNA 为阴性对照，以无菌水为空白对照。样品、阳性对照、阴性对照和空白对照设置两个平行的反应体系，分别进行靶基因和内参基因扩增，以Ct 平均值为最终结果。

依据实时荧光PCR 原理及相关食品检测国标，设定判定原则：空白及阴性对照应Ct 值≥40.0，无典型扩增曲线；内参对照Ct 值＜30.0，有典型扩增曲线；当Ct 值≤35.0，有典型扩增曲线时，判定为检出；当Ct 值＞35.0，无典型扩增曲线时，判定为未检出。

1.4.4 引物特异性

真核生物18S rRNA 引物探针对所有原料DNA按1.4.3 进行扩增，以确定DNA 提取质量，防止假阴性结果。

利用莜麦、红薯、玉米、马铃薯、木薯引物探针，对10 种原料按1.4.3 方法分别进行扩增，来测试引物探针的特异性。

1.4.5 灵敏度

（1）绝对灵敏度。用无菌水10 倍梯度稀释莜面、红薯、玉米、马铃薯、木薯的DNA（10.00 ng·μL-1、1.00 ng·μL-1、0.10 ng·μL-1、0.01 ng·μL-1），按1.4.3节方法分别进行扩增。

（2）相对灵敏度。莜面中分别掺入自制红薯、玉米、马铃薯、木薯淀粉，制成质量分数为50.0%、10.0%、5.0%、1.0%、0.1%的掺假模型，按1.4.1 提取DNA，按1.4.3 节分别扩增。

1.4.6 市售样品检测

利用建立的实时荧光PCR 方法对20 份市售莜面进行检测，鉴别其是否掺杂其他食用植物淀粉。

2 结果与分析

2.1 特异性结果分析

18S rRNA 引物探针扩增原料DNA（图1），均产生显著的荧光扩增曲线，Ct 值在18.5 ～22.5，空白对照Ct 值为40.0，说明从原料中均能提取到适用于扩增反应的DNA。

图1 特异性试验结果

所有原料DNA 分别经莜麦等5 种引物探针扩增（图1），反应体系中靶标成分莜麦、红薯、玉米、马铃薯、木薯分别产生显著的荧光扩增曲线，Ct 值均在20.0 ～23.0，而非靶标成分及空白对照Ct 值均为40.0，说明5 种引物探针均有良好的物种特异性。

2.2 灵敏度结果

2.2.1 绝对灵敏度

实时荧光PCR 扩增结果如图2，DNA 质量浓度为0.01 ng·μL-1及以上时，呈现显著扩增曲线，说明绝对灵敏度可达0.01 ng·μL-1。

2.2.2 相对灵敏度

实时荧光PCR 扩增结果如图3，掺入淀粉的质量分数为0.1%及以上时，呈现显著扩增曲线，说明相对灵敏度可达0.1%。

图3 实时荧光PCR 相对灵敏度

2.3 市售样品检测

利用建立的实时荧光PCR 方法对20 份市售莜面进行检测，结果未发现莜面中掺杂食用淀粉情况。今后可重点关注小作坊、小摊贩、小餐饮以及农贸市场等环节的莜面掺杂情况。

3 结论

本研究采用实时荧光PCR 法，通过对莜麦、红薯、玉米、马铃薯、木薯种属基因组DNA 的特异性扩增，建立了莜面中掺杂植物源性淀粉的检测方法。该检测方法具有良好的特异性和灵敏度，条件稳定，可检测市售莜面掺杂食用淀粉的情况。