HPLC法测定加味甘露消毒丹中大黄素的含量

刘永谦 廖馨然 刘付伟清 王涛

1广东省妇幼保健院药学部，广州 511442；2广州中医药大学中药学院，广州 510006；3广东省妇幼保健院妇科，广州 511442

甘露消毒丹，又名普济消毒丹，由清代叶天士所创，始载于《医效秘传·卷一》，由滑石、茵陈、黄芩等药味组成的温病名方，主治湿温时疫、湿热并重等症，临床上用于手足口病、肝炎、流感、腮腺炎等治疗。许多研究表明，加减甘露消毒丹对手足口病具有较好的临床疗效，可有效改善患儿的临床症状，并在人体内具有较好的抗病毒作用［1-15］。其已在广东省妇幼保健院作为常规手足口病治疗的临床方加以广泛应用。常用的加味甘露消毒丹是在此方的基础上略作调整，去除石菖蒲、木通，另外加入通草、柴胡、僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄等药味，且重用了大黄。大黄素是一种蒽醌类衍生物，化学名为1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌，是中药大黄的主要有效单体［16］。有大量研究结果表明，大黄素对EB病毒、乙肝病毒、巨细胞病毒、冠状病毒等有抑制作用，有证据表明其也具有杀病毒效应［17-28］。另有研究表明，大黄素通过抑制TLR3途径，在通过CVB3介导的手足口病引起的脑炎中发挥保护作用［29］。

为有效地控制药品质量和保证用药安全，本研究以具有抗病毒作用的大黄素作为质量控制指标，采用高效液相色谱（HPLC）法测定加味甘露消毒丹中大黄素的含量，用于该方的质量控制，拟为该经典方的质量标准完善提供实验数据支持。

材 料

1.实验仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪、SHIMADZU AUY120型电子天平（岛津企业管理有限公司）、Precisa EP225SM-DR微量双量程电子分析天平（普利赛斯称重设备有限公司）。

2.实验试药

甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂为分析纯。大黄素（含量测定用，批号C10217232，纯度≥98%）购自上海麦克林生化科技有限公司，组方中浙贝母（批号：191205901）、滑石（批号：191001761）、姜黄（批号：190901001）、僵蚕（批号：191100119）、蝉蜕（批号：190704961）、黄芩片（批号：191001021）、通草（批号：190901061）、茵陈（批号：190902571）、广藿香（批号：191000991）、大黄（批号1：190800099，批号2：200300059，批号3：200100011）、薄荷（批号：190901101）均购于康美药业股份有限公司，连翘（批号：1909001）、北柴胡（批号：2009001）、射干（批号：2003001）、白蔻仁（批号：2003001）均购于岭南中药饮片有限公司。

方法与结果

1.对照品储备液和溶液的制备

精密称定大黄素对照品，加甲醇超声（功率为150 W，频率为40 kHz）溶解，制成1 ml含80.00 μg大黄素的对照品储备液。精密吸取10 ml上述对照品储备液，置于100 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度即得1 ml含8.000 μg大黄素的对照品溶液。对照品储备液及对照品溶液均保存于2～8 ℃冰箱中备用。

2.供试品溶液的制备

取加味甘露消毒丹方内各药，按组方单味药及取样量分别称取浙贝母、滑石、姜黄等前10种单味药，精密称定，置250 ml圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，加热回流1 h，再加入茵陈、广藿香、大黄、薄荷、白蔻仁5种后下药，继续加热回流10 min，放冷，滤过。精确吸取20～50 ml续滤液，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理1 min，加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用三氯甲烷洗涤容器，洗涤液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层。酸液用10 ml三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液至100 ml圆底烧瓶，减压回收溶剂至干，残渣加70%乙醇使溶解，转移至50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

3.阴性样品溶液的制备

根据加味甘露消毒丹的处方和工艺，准备缺大黄药材的阴性样品，按供试品溶液的制备方法同法制备缺大黄的阴性样品溶液。

4.色谱条件［30］

色谱柱：Agilent ZORMAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），根据表1进行梯度洗脱；进样时间：15 min；检测波长：254 nm；柱温：室温；进样量：10 μl。

表1 梯度洗脱程序（%）

5.系统适用性试验

在“4”项色谱条件下，依次进样对照品溶液（4.000 mg/L）、供试品溶液和阴性样品溶液进行测定，结果见图1。结果显示，理论塔板数按大黄素计算不低于3 000，目标峰与其相邻峰的分离度大于1.5，分离完全，大黄素的测定不受其他组分的干扰。阴性样品中，在大黄素的保留时间处无吸收峰，表明此方法专属性良好。

图1 大黄素对照品（A）、供试品溶液（B）、阴性样品溶液（C）的高效液相色谱图

6.线性关系考察

分别精密吸取2.5 ml、4.0 ml、5.0 ml、7.5 ml、10.0 ml对照品溶液，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇溶液至刻度，制得每1 ml含大黄素分别为2.000、3.200、4.000、6.000、8.000 μg系列浓度对照品溶液。精密吸取制得的对照品溶液，在“4”项下的色谱条件下，分别进样测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、大黄素浓度（X）为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得到大黄素的线性回归方程为Y=223.93X+10.85，R2=0.999 8，即大黄素在浓度为2.000～8.000 mg/L的浓度范围内与对应的色谱峰面积呈良好线性关系。

7.精密度试验

精密吸取对照品储备液和溶液制备项下的8 mg/L对照品溶液，在“4”项的色谱条件下，连续进样测定6次，记录色谱峰面积，并计算相对标准差（RSD），结果显示大黄素峰面积的RSD（n=6）为0.13%，表明实验所用仪器精密度良好。

8.重复性试验

根据实验试药项下的批号和取样量，取同一批号的大黄组方进行试验（批号190800099，S1），分别按供试品溶液的制备项下的方法平行制备6份供试品溶液，在“4”项的色谱条件下，依次进样测定，记录峰面积，计算平均含量和RSD，结果显示大黄素的平均含量（n=6）为14.23 mg/L，RSD为2.59%，表明本实验所用方法重复性良好。

9.稳定性试验

取一份供试品溶液，在“4”项的色谱条件下，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定峰面积，计算RSD为2.20%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

10.加样回收率试验

根据实验试药项下的批号和取样量，取同一批号的大黄进行试验（批号190800099，S1），精密移取4.5 ml对照品溶液，置于250 ml圆底烧瓶中，分别按供试品溶液的制备项下的方法平行制备6份供试品溶液，在“4”项的色谱条件下，进样测定，并记录峰面积，计算加样回收率和RSD，结果见表2，表明本实验所用方法加样回收率好，适用于加味甘露消毒丹中大黄素的测定。

表2 加样回收率实验结果（n=6）

11.样品含量测定

以实验试药项下的批号和取样量，按供试品溶液制备下的方法制备供试品溶液，在“4”项的色谱条件下，分别进样测定，记录峰面积，根据回归方程，用外标法计算大黄素的含量，结果参见表3。

表3 加味甘露消毒丹中大黄素的含量（n=3）

结 论

参考文献及药典中有关大黄素测定波长的报道，因其在254 nm处有最大吸收，故而本复方中大黄素的检测波长确定为254 nm。洗脱剂系统是影响其含量测定的关键因素之一。洗脱剂系统首先尝试了药典甲醇-0.1%磷酸溶液的体系，但本复方中药味多，干扰成分比较多，在等度洗脱的条件下易导致其他成分对大黄素测定的干扰，分离度不符合要求，经过梯度法变更流动相比例后，恰好使大黄素和其他化学成分有效分离，而且峰形对称。

样品的提取方法是影响其含量测定的另一关键因素。供试品溶液制备时，曾考察超声和回流两种提取方式的差异，发现回流方式对复方中化学成分的提取效率更佳，故确定了超声的提取法。

本实验采用HPLC法对加味甘露消毒丹中的大黄素进行了含量测定，使用方法简便快捷、准确可靠，分离效果理想，重复性良好，可用于加味甘露消毒丹的质量控制，并为该经典复方质量标准提升提供数据支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明刘永谦：提出研究选题，设计研究方案，查阅文献，修订论文；廖馨然：查阅文献，试验操作，起草论文；刘付伟清：查阅文献，统计分析；王涛：提出研究选题，设计研究方案，查阅文献，修订论文，指导性支持