兽用疫苗生产中支原体污染检测及预防

文│康一岚 徐慧琳 杨代蓉 魏嘉 刘玉静 申茂欣 赵同渊 夏娜*（青岛易邦生物工程有限公司）

在兽用疫苗生产的过程中，特别是对细胞培养过程中，极易被支原体污染，严重地影响了疫苗的质量及安全，对于普通疫苗和细胞生产活毒疫苗的污染，会给疫苗生产商或使用不合格疫苗的养殖户带来极大的经济损失，同时也不利于畜禽疾病防控工作的顺利开展。其中支原体是疫苗生产过程中比较常见的微生物，而造成支原体污染的原因也较多，工作环境、培养基、被污染的细胞、试验器材等都可能造成支原体的污染，从而使疫苗质量下降，安全性及免疫效果难以达到标准。因此，建立快速有效的支原体检测方法，可以有效地检测出支原体污染，避免给后续过程带来更严重的损失，如今检测支原体污染的方法很多，培养法、DNA荧光染色法、酶联免疫吸附试验（EILSA）方法、聚合酶链式反应（PCR）等方法，都被广泛运用于检测支原体污染或进行初步筛选，保证后续疫苗的生产过程。同时要结合生产实际，针对兽用疫苗支原体污染的主要来源制定出科学有效的预防措施，确保兽用疫苗无支原体污染，从源头杜绝支原体污染给兽用疫苗生产带来的严重影响，保证兽用疫苗的质量、安全及效果。

一、支原体的特点

支原体属于原核微生物，是能够进行自我复制的最小原核生物，没有细胞壁，结构简单，大小在细菌和病毒之间，可以通过细菌过滤器。对热十分敏感，在偏碱环境中生存且对酸性环境抵抗力差，一般抗生素不敏感。若动物感染后，其毒株通过特殊结构黏附在细胞膜上，引起结构改变，导致宿主细胞免疫反应异常，会引起疾病的发生。

二、支原体污染来源

1.生产用原材料污染源。在疫苗生产过程中所用原材料污染源要十分注意，尽可能减少疫苗污染支原体的风险，在兽用疫苗生产中，若是用到动物或鸡胚时，不能因节省成本随意购买动物或鸡胚，这样难以保证疫苗的质量及安全，其次在使用动物的脏器或组织制备原代细胞或是组织时，也要对来源进行规范及严格要求，否则支原体污染则难以控制。

2 .细胞和种毒支原体污染。细胞及种毒在兽用疫苗生产中十分关键，是疫苗质量及效果的决定因素。其中细胞的支原体污染非常严重，据统计，在细胞培养过程中被支原体污染的风险高达50%～60%，也是细胞培养中的一大难题，常见的污染细胞的支原体主要有口腔支原体、唾液支原体、莱氏无胆甾支原体等人源、猪源和牛源三类，而且已有的细胞系也有30%～50%已被支原体污染，虽然在细胞培养中难以发现，但因支原体传染性高，易发生交叉污染，若是细胞株来源不纯或运输保存过程中被污染极易将支原体引入，而引入支原体污染源后，会造成细胞株被感染的现象，对疫苗的生产产生极大影响；其次若是在种毒过程中感染了支原体，则会出现逐级放大的效果，会严重影响疫苗的质量。

3.培养血清及胰酶支原体污染。使用疫苗的生产中，血清和胰酶作为其中不可缺少的培养细胞的主要材料，而在疫苗生产过程中常用的是动物血清，也是细胞培养中不可或缺的天然培养基，动物血清也是潜在支原体污染的来源，而且极易被支原体污染，被污染后不能用除菌过滤膜过滤支原体。而且如今血清的规范及要求还没有相应的标准，不同厂家的血清来源不同，工艺及质量也就有差别，特别是血清中的有效成分及支原体状况存在较大差距，因此培养血清也是支原体污染的重要来源；其次胰酶也是用于疫苗生产过程中细胞培养时传代、消化所需，一般从羊、牛等动物胰腺取得，也非常容易污染支原体，而后会污染细胞，对疫苗的质量及安全也存在较大支原体污染风险。

4.培养基支原体污染。培养基是细胞培养过程中重要的原材料，培养基的很多成分其来源都是动物性产品，对此培养基中成分的优劣影响着培养基的好坏，进一步对细胞培养产生影响，而培养基也极易被支原体污染或是在培养过程中被污染或是在生产过程中被污染，对此在购买培养基时就不能因节约成本购买来源不清、说明不清的培养基，要杜绝培养基产品的支原体污染风险，减少疫苗生产过程中支原体感染的风险。

5.器材及人员支原体污染。在兽用疫苗生产过程中用到的器材及生产人员支原体污染在疫苗生产中要尤为重视，特别是在细胞培养过程中用到培养器皿及培养箱的会对细胞的培养产生影响，特别是气体、温湿度、pH值和生长密度等都会给支原体生长繁殖的空间，进而更容易污染细胞。器材生产人员在培养细胞或在进行疫苗生产的其他步骤中没有注意环境及试验操作，导致细胞被污染，造成疫苗的质量及安全不达标。

6.环境支原体污染。在疫苗生产的过程中对环境的要求尤为重要，需要在无菌的环境中进行细胞培养，而超净工作台就是培养细胞时试验的区域，对于没有灭菌完全的超净工作台，支原体可以在其表面存活4～6天，在进行细胞培养操作过程中进行感染。被感染后的细胞难以通过传代或过滤去除支原体，对此在环境中要在试验前后进行消毒灭菌，保证环境的无菌。

三、支原体检测的方法

在疫苗生产过程中受到较多因素影响，易导致支原体污染，对此就要对其进行支原体检测，排除被污染的可能，就需要借助相关的检测技术进行支原体检测，常用的方法是直接培养法、DNA荧光染色法，酶联免疫吸附试验，PCR检测法等方法进行检测。

1.直接培养法。直接培养法是检测支原体的标准方法。是把样品接种到支原体培养基上进行培养，并通过观察液体培养基的颜色变化或是固体培养基上是否生长支原体菌落进行判断，但培养法所需培养时间较长，要3～4周左右的时间，其次用培养法不能在同一培养基中检测出所有的支原体类型，该方法常用于对种毒或疫苗成品的支原体检测。

2.DNA荧光染色法。DNA荧光染色法，是把要检测的样品接种在指示细胞中进行培养，然后用特异性荧光染料进行染色，再用荧光显微镜进行观察，通过附着在细胞表面的支原体DNA的着色情况判断该样品是否被支原体污染。该方法用时短，可进行多个样品检测，还能检测出使用直接培养法难以检测出的支原体类型，对此可以用该方法在配苗前初步筛选，去除污染样品，进一步减少疫苗生产中产生的损失，保证疫苗的质量及安全。根据研究发现DNA荧光染色法比直接培养法更为敏感、方便，耗时短、准确稳定。但使用DNA荧光染色法要注意对细胞源疫苗或细胞培养过程中的检测，因细胞核酸碎片会对检测产生影响。

3.酶联免疫吸附试验。酶联免疫吸附试验即ELISA检测法，对诊断支原体是较方便和准确的方法之一，常见的ELISA检测法有间接法和抗原竞争法等，检测支原体都有较好的特异性及敏感性，并且可以一次性进行多样品检测，目前ELISA检测法已经被广泛用在兽医学领域，并且成为检测支原体的常规方法之一，一般是通过比色法得出相应的结果进一步来判定是否有支原体污染的情况。

4.聚合酶链式反应（PCR）检测法。PCR方法是一种DNA复制的体外扩增方法，由于支原体生长缓慢对营养环境要求较高，对支原体直接培养法检测还有一定局限性，而PCR检测法相对于直接培养法更为快速、敏感，并且在兽用疫苗的生产过程中推广及应用。其中的巢式PCR检测法是在普通PCR检测方法上进行优化改进的，通过巢式PCR引物扩增后存在的目的片段情况进行合理判断，并可以对支原体类型进行准确的分析及判断，进一步对污染源进行判断。而实时荧光定量PCR技术已经在多个领域进行运用，通过荧光信号变化对PCR扩增反应的Ct值和标准曲线进行定量分析，该方法灵敏、重复性高，但标准品难以获得、检测成本较高等因素影响，限制了该方法的应用。

四、支原体污染预防

在兽用疫苗生产过程中的各个环节都有被支原体污染的可能，对此就需要在疫苗生产的各个环节把好质量，并进行检测，排除支原体污染的风险。

1.把好材料关。在疫苗生产过程中所运用到的材料，有鸡胚、动物、细胞及培养细胞所用的血清、胰酶、培养基等都有存在支原体污染的可能，对此在疫苗生产过程中就需要保证材料的纯净，同时要对动物、鸡胚、细胞进行检测，排除支原体污染的可能，如果条件允许可以使用无支原体污染的SPF动物及鸡胚，保证试验用动物及鸡胚无污染；其次在细胞培养过程中对细胞进行检测及培养细胞所用的试剂仪器要进行无菌配制或高压蒸汽灭菌，减少支原体污染的可能，同时也要保证血清和培养液等试剂的成分及来源，从源头减少支原体污染风险。

2.优化环境关。在疫苗生产过程，生产环境尤为重要，要对生产环境定期消毒灭菌，并对生产环节中可能带来污染来源的路径进行严格把控，避免交叉感染。其次要对使用的仪器进行高压蒸汽灭菌或紫外消毒灭菌，确保生产环境得到充分彻底的消毒灭菌，并保证进入生产空间的所有物品进行消毒或紫外照射，保证生产环境不会被支原体污染。

3.严格把控生产关。兽医疫苗的生产中，严把生产关对支原体污染的防控非常重要。首先在生产中要加强对人员的管理，严格要求所有人员按照规范进行操作，减少支原体污染的可能；其次要强化在生产中的消毒灭菌，并进行检测，防止支原体通过器具、物品进行污染；同时要合理地使用抗生素，选择对支原体有抑制作用的抗生素，可添加在细胞培养基或胰酶中，减少支原体污染细胞，给疫苗生产带来更大的风险。

五、结语