木薯FRK1类似基因的分离及表达分析

吴金山 陆小静 王思琦 黄家权 张逸杰 贾迎雪 陈银华

关键词：木薯；FRK1类似基因；生物信息学；表达分析

果糖激酶（fructokinase，FRK）是植物细胞中果糖磷酸化的主要催化酶、变构酶和高效酶，其国际系统分类编号为EC2.7.1.4，是植物糖代谢的“控制阀”，在植物生长发育过程中主要调控植物的糖代谢、生长发育和响应生物/非生物胁迫等作用，是一种必不可少的不可逆酶[1]。目前，已有20多种植物分离鉴定出FRK基因[2]，如甜菜直根[3]、大豆[4]、马铃薯块茎[5]、番茄果实[6-7]、豌豆、菠菜叶片、水稻、苹果、玉米、百合花粉、毛果杨、枇杷[8]、大麦、甘蔗、鳄梨、山茶花粉[1，8]、棉花、谷子、高粱[8]、木薯[9]、北美云杉和蜜柑[10]等，但对其研究主要集中在果糖磷酸化及其基因表达方面，而在模式植物拟南芥中的研究相对较为深入。

FRK作为植物糖代谢过程中重要的碳通量调节激酶，其在植物逆境胁迫中发挥着重要作用。Z?RB等[11]通过对甘蔗基因组进行搜索鉴定，共发现7个FRK基因，在干旱胁迫诱导下，其基因家族中只有SsFRK3和SsFRK5两个基因表达量呈显著上升变化趋势。在玉米中，短期的盐胁迫可使FRK2基因的表达量上调；在向日葵植株中，利用干旱胁迫诱导，FRK基因表达呈上调趋势，同时发现其幼苗叶片中FRK基因表达量上调了3.3倍，暗示FRK在干旱胁迫下发挥着重要作用[12]。目前有关FRK抗病分子机理研究在大豆、玉米、水稻、大麦等作物上有涉及[1]。

木薯（ManihotesculentaCrantz）为多年生灌木状植物，因其块根富含淀粉类物质，与马铃薯、甘薯一同被称为世界三大薯类作物，是热带地区的重要口粮。其主要分布在我国南方的热带亚热带地区，如广西、广东、海南等省（区），其中广西种植量最大，产量位居第一。木薯在种植过程中主要病害有8种，细菌性萎蔫病（Cassavabacterialblight，CBB）是危害最为严重的病害之一，严重时可造成高达90%的产量损失[13]。目前CBB抗病分子机理还不清楚。在拟南芥中，FRK1是先天免疫下游标记基因，该基因的表达意味着病原相关分子模式触发的免疫反应（PAMP-triggeredimmunity，PTI）途径的启动。因此，本研究以模式植物拟南芥为参照，采用同源序列法识别木薯FRK1类似基因并对其进行生物信息学及表达量分析，以期进一步推动木薯PTI相关研究，从而加快高产抗病木薯品种选育工作的步伐。

1材料与方法

1.1材料

以木薯SC8品种30d组培幼苗为材料，水培炼苗1周后进行处理，共设置3个处理，各处理分别为：①100μmol/L水杨酸（SA），②100μmol/L茉莉酸（JA），③黄单胞菌（Xam，OD600为0.6～0.8）。每个处理20株苗，3个重复。SA、JA利用喷雾的方式进行处理，Xam利用剪叶法接种进行处理，以无菌水作为对照。SA、JA处理后分别在0（CK）、15、30、60、120min取样，病原菌Xam处理后分别在0（CK）、2、4、8d取样，取样部位均为植株叶片，每个样品各取10片叶用锡箔纸包好后置于–80℃备用。

1.2方法

1.2.1木薯叶片总RNA的提取及cDNA合成取木薯叶片0.1g，速冻研磨，参照植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书进行木薯叶片总RNA的提取。完成后迅速将总RNA溶解到30μL无酶无菌水中，加DNAⅠ消除总RNA中少量DNA，并用1%琼脂糖凝胶检测RNA条带的完整性及DNA的消除情况。取5μL总RNA反转录合成cDNA，具体实验步骤参照RevertAidFirstStandcDNAsynthesis（Thermo）说明书进行。

1.2.2木薯FRK1类似基因的筛选在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protrin/）数据库检索得到拟南芥FRK1基因的相关信息（ORF序列和氨基酸序列），然后在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）网站上下载木薯全基因组等相关数据[14]。以拟南芥FRK1蛋白作为输入序列，运用BLASTP软件对木薯FRK类似基因进行搜索鉴定，e值设置为–10。

1.2.3木薯FRK基因生物信息学分析（1）木薯FRK基因家族同源性分析。運用ClustalW软件对拟南芥FRK1氨基酸序列和木薯FRK氨基酸序列进行多序列联配分析，序列比对结果通过软件Mega7（http：//www.megasoftware.net/）的邻接法（neighbor-joiningmethod，NJ）构建系统进化树，Bootstrap值设为1000。

（2）木薯FRK类似基因的结构分析。木薯FRK基因的内含子和外显子信息下载于Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）网站，使用在线网站GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）绘制基因模式图。

（3）木薯FRK类似基因的保守基序分析。利用蛋白质保守基序在线搜索程序MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）预测木薯FRK蛋白的保守基序，设置查找基序重复的数量为“any”。

（4）木薯FRK类似基因染色体定位分析。运用在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）网站上下载的木薯FRK类似基因信息制作染色体定位图。

（5）木薯FRK上游基因共表达分析。使用在线网站STRING（http：//www.string-db.org/）的数据库，得到拟南芥FRK1蛋白互作网络图。预测木薯FRK1蛋白的互作关系。

（6）木薯FRK基因响应逆境的表达值热图。在NCBI的SRA（sequencereadarchive）数据库中下载Xam（Xanthomonasaxonopodispv.manihotis）细菌侵染木薯所得的3个转录组数据包[15]（SRR1050891、SRR1050892、SRR1050893）。参考文献[16]的方法计算MeERF基因在生物胁迫处理下的RPKM值。用Mev（MultiExperimentViewe）软件对数据进行处理，内置HCL程序进行层次聚类[16]。

1.2.4MeFRK1基因Real-timePCR表达分析利用Oligo7软件对MeFRK1基因进行特异性引物设计，随后利用一般PCR试验检验其扩增特异性。使用在线网站NCBI的BLAST检索确认设计的Real-timePCR引物的特异性。所用引物序列为MeFRK1-F：5-TTCGGTTCCTTTTGCTCTCG-3，MeFRK1-R：5-TGCCATGAGGATGACTACCAA-3。引物合成由华大基因科技服务有限公司完成。

Real-timePCR扩增程序为：95℃30s；95℃5s，55℃30s，72℃30s，25个循环；72℃延伸10min。结果采用2–△△CT的计算方法进行相对定量，以木薯EF1a基因作为内标校正模板量。每个样品3个生物学重复。各激素处理时间点MeFRK1基因的表达水平与处理0min（处理前）相比。使用SigmaPlot软件处理数据并制图。

2结果与分析

2.1木薯FRK1同源基因分析

利用AtFRK1的蛋白序列进行搜索，共获得8条木薯FRK类似基因，按照比对结果顺序命名为MeFRK1～MeFRK8，具体信息见表1。在木薯基因组中，8个FRK类似基因氨基酸长度各不相同，位于804～921aa之间，其中最长的是MeFRK8，有921个氨基酸，最短的是MeFRK3，有804个氨基酸，蛋白质序列平均长度为863aa（表1）。基因在染色体上的位置信息是研究基因家族进化和功能的重要证据。8个FRK类似基因在木薯染色体上呈不均匀分布，其中MeFRK1位于4号染色体上，MeFRK4、MeFRK5、MeFRK6、MeFRK7、MeFRK8均位于11号染色体上，而MeFRK2和MeFRK3位于核骨架Scaffold上（表1，图1）。

2.2木薯FRK类似基因同源性及结构分析

由图2可知，MeFRK1～MeFRK8和AtFRK1同源性分析可将其分为两大类。第一大类主要有5个基因，分别为MeFRK2、MeFRK3、MeFRK4、MeFRK6、MeFRK8，属于同一亚族[17]。其中MeFRK2和MeFRK6的同源性为99%，MeFRK8与组中各基因的同源性均较高，为100%。第二大类主要有4个基因，分别为AtFRK1、MeFRK1、MeFRK5和MeFRK7，其中MeFRK5和MeFRK7与AtFRK1的同源性为50%，为旁系同源性，MeFRK5和MeFRK7的同源性更近，为100%。通過对9个基因的同源性分析发现，8个木薯FRK类似基因与AtFRK1存在较高的同源性，同时木薯8个FRK类似基因间也存在较高的同源性。该基因家族中存在如此多的同源旁系基因，可能与木薯在适应不同的生长环境而进行有序的基因表达存在一定的关联[18]。根据基因结构分析结果（图3），也可将8个类似基因分为两大类，其结果与进化树结果一致。

2.3木薯FRK类似基因编码蛋白保守基序分析

通过保守基序预测发现，8个MeFRK蛋白与AtFRK蛋白均存在3个相同保守基序Motif1、Motif2和Motif3（图4），基序长度位于50～250aa之间（表2）。其中，Motif1为酪氨酸蛋白激酶（proteintyrosinekinase，PTK）结构域，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。Motif2为内质网碳水化合物结合蛋白（carbohydrate-bindingproteinoftheER）结构域。Motif3为富含亮氨酸重复（leucinerichrepea，LRR）结构域，参与蛋白质的相互作用，是已知抗病蛋白的重要结构。

综上，8个MeFRK蛋白可能均参与蛋白质间的相互作用。其中，MeFRK1与AtFRK1的同源性最近，为旁系同源性。因此初步筛选MeFRK1基因为木薯基因组中先天免疫下游标记基因。

2.4木薯FRK基因上游基因共表达分析

由图5和表3可知，预测MeFRK1蛋白与10个蛋白存在互作关系，其中8种与2C型蛋白磷酸酶（proteinphosphatase2c，PP2C）相关，WRKY6也涉及其中。PP2C基因在脱落酸（abscisicacid，ABA）、茉莉酸（jasmonicacid，MeJA）以及水杨酸（salicylicacid，SA）等激素信号转导途径中发挥着重要作用，参与调节木薯在高渗、干旱以及低盐等逆境中的生存能力[19-20]。由此可推测，FRK1基因也可能参与木薯的生长发育，是木薯应对不同逆境潜在信号因子之一。另有研究显示，WRKY转录因子家族广泛参与植物的生长发育、代谢调控、生物胁迫与非生物胁迫应答等过程，是植物免疫系统中许多信号通路的核心组成部分，如PTI基础防御以及ETI系统获得性抗性，对于木薯抗病性的研究具有重要的指导意义[21]；而WRKY6在木薯响应生物胁迫时呈正调控作用，进而推测FRK基因家族也参与木薯生物胁迫应答过程。

2.5木薯FRK基因响应逆境的表达值热图

通过对各基因接菌Xam前后叶片表达量变化趋势分析发现，随着时间的推移，MeFRK1和MeFRK3的表达量呈不断上调的变化趋势，但MeFRK1的变化趋势更明显；MeFRK2、MeFRK4、MeFRK6三个基因表达量呈先下调后上调且表达水平接近；而MeFRK8表达量呈先上调后下调的变化趋势，MeFRK7不断下调，但MeFRK5一直维持在一个相对较稳定的水平（图6）。

2.6不同处理叶片中MeFRK1基因表达量测定

利用Real-timePCR法测定SC8组培幼苗叶片MeFRK1基因在SA、JA和病原菌Xam三种处理下的瞬时表达量[22]，结果发现，其在3种处理下基本均呈先上升后下降的变化趋势（图7）。在激素SA、JA处理后15min时二者达到最大值，而在病原菌Xam处理后第4天时达到最大值，其表达量是激素SA处理时最大值的2.84倍，是JA处理后的3.06倍。由此可以说明，病原菌Xam胁迫更能诱导MeFRK基因的表达，有助于提高木薯对病原菌Xam的抗性。本研究通过对木薯MeFRK1基因瞬时表达的研究，为分离鉴定木薯PTI途径下游的标记基因，研究木薯抗病分子机理有着重要的意义。

3讨论

木薯因富含淀粉被誉为“淀粉之王”“地下粮仓”等[23]。而FRK是植物中糖代谢的关键酶，因此研究FRK对木薯淀粉的储藏、改善食用风味，提高抗病能力等有着重要的作用。研究发现，植物中果糖可作为信号分子直接或通过与其他信号通路交叉调节基因的表达，在植物遭受逆境胁迫中发挥重要作用[24]。近年来，随着生物信息学技术普遍应用及基因组学、蛋白组学的研究快速发展，有更多潜在的FRK基因在多种植物中被挖掘。如FRK1在番茄整株植株中均有表达，FRK2具有库特异性，而在源器官中表达很低[6]。FRK在缺氧条件下对水稻幼苗碳水化合物代谢发挥着重要作用，在转录水平上，OsFRK1优先在有氧条件下表达，而OsFRK2需要在缺氧条件下表达[2]。

目前，有关木薯中FRK基因的抗病性还不清楚。本研究基于拟南芥先天免疫下游标记基因FRK1，通过搜索从木薯基因组中筛选出8个类似基因。随后利用生物信息学中的软件对其进行同源性、在染色体中的位置、蛋白结构以及蛋白质间的相互作用等进行分析。结果发现，MeFRK1、MeFRK5和MeFRK7三个基因与AtFRK1亲缘关系最近，基因相似度最高，由此推断，此4个基因在起源上存在一定的相关性。通过染色体定位发现，8个FRK类似基因在木薯染色体上呈不均匀分布，可能分别在木薯生长发育过程中承担不同的功能。在8个基因中只有MeFRK1位于4号染色体，与AtFRK1属于旁系同源，其余5个位于11号染色体上，其结果与双子叶植物拟南芥等的FRK家族成员在染色体定位基本一致[1]。通过保守基序分析发现，9个蛋白存在3个相同的保守基序，长度位于50～250aa間，且基序的次序和间隔长度比较保守。该家族基因编码蛋白基序的保守性暗示在木薯中不同的FRK蛋白可能存在功能冗余现象。同时对3个保守基序功能进行分析发现，Motif3参与了蛋白质间的相互作用，是已知抗病蛋白的重要结构[25]。木薯FRK1类似基因不仅与拟南芥FRK1基因亲缘关系较近，基因结构相似，且二者的功能也类似。由此初步筛选MeFRK1为木薯基因组免疫下游标记基因。

激素是植物对生物非生物胁迫反应的调节剂，参与各种复杂的信号转导通路，以此调节不同的应激反应。水杨酸（SA）、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）4种激素主要调节植物对病原体的防御[26]。当用激素处理植物后，其PRRs识别PAMPs分子，短时间内植物做出的应答反应就包括启动水杨酸、茉莉酸信号传导途径[27]。基因表达模式分析在一定程度可推测基因的分子功能，有利于对该基因功能的研究。本研究通过SA、JA的喷施、黄单胞菌（Xam）的侵染3种方法分别处理木薯叶片，通过分析处理后木薯叶片中FRK1基因在不同时间的表达量变化。结果发现，MeFRK1基因的表达量在3种处理下呈差异性表达，表明此基因可能是木薯生物逆境胁迫系统中的关键标记因子。在SA处理后，MeFRK1的表达量在15min时达到最高值，其余时间均表现为下调。同样，在JA处理后，15min时表达量也远高于对照组，是对照组的1.5倍以上，随之下降，在60min和120min的表达量接近于零。说明此基因在响应SA和JA信号途径时，短时间内具有正调控作用，且反应较为迅速。在响应生物胁迫时，3个时间的相对表达量均高于对照组，在第4天时达到最高值，接近对照的5倍。由此说明，此基因对于病原相关分子机制能够做出快速响应，暗示其可能与抗病途径有关。

植物在生长发育过程中，经过长期对逆境的适应，自身也产生一些免疫防御机制，通过上调或下调某个或某些基因的表达量来调控逆境有关信号通路以适应环境的变化[16]。而植物细胞中的糖类物质可在FRK作用下通过活化免疫反应参与植物防卫过程，在病原菌等生物胁迫中发挥重要作用[28]。木薯是热带地区重要的粮食及能源物质，其在生长发育过程中面临着病虫害等多种生物非生物的胁迫，严重影响了木薯的产量和品质。因此，提高木薯抵抗逆境胁迫的能力至关重要。本研究通过对木薯FRK类似基因进行筛选分析，并在3种处理情况下验证其瞬时表达量，其结果可为后期验证木薯FRK基因的功能、研究其相关信号通路及抗病调控机理提供参考。