火龙果软腐病病原菌鉴定及链霉菌菌株LWL1827的防效测定

张鸿雁 陈盈营 周雁微 林丽静 刘锴栋

关键词：火龙果；串珠镰刀菌；链霉菌；拮抗作用

火龙果又称仙蜜果、红龙果、情人果，属仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）或蛇鞭柱属（Seleniereus），原产于热带中美洲地区，20 世纪90 年代初引入我国台湾后被驯化试种，后陆续在海南、广西、广东、福建等地推广种植。火龙果不仅有丰富的营养成分，还具有抗肿瘤、抗氧化、调节激素及解毒等功效。随着火龙果种植面积的不断扩大，销售储藏量的增加，储藏病害种类也越来越多，发病程度也越来越重。李敏等[1] 发现胶孢炭疽菌（ Colletotrichum gloeosporioides）、MEETUM 等[2]发现亚洲炭疽菌（C.aenigma）和暹罗炭疽菌（C. siamense）、LI 等[3]发现平头炭疽菌（C. truncatum）均可引起火龙果炭疽病。姚昇华等[4] 发现仙人掌平脐蠕孢（Bipolaris cactivora），郑樊等[5]发现双间柱顶孢（Scytalidium dimidiatum）是火龙果果腐病的主要病原菌，GUO 等[6]发现桃吉尔霉（Gilbertellapersicaria）亦可引起火龙果果腐病。王会会等[7]发现引起火龙果溃疡病的病原菌是新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）。

火龙果软腐病是火龙果储藏时期的主要病害。发病部位变褐软腐，甚至全部腐败，造成巨大的经济损失[8]。崔志婧等[9]发现尖孢镰刀菌（F.oxysporum）是上海进口火龙果软腐病最主要的病原真菌。林珊宇等[10]发现木贼镰刀菌（F. equiseti）亦能引起火龙果软腐病。但未见串珠镰刀菌（F.verticillioides）引起火龙果软腐病的报道。对火龙果软腐病病原菌的分离鉴定可对火龙果储藏病害的防治提供理论依据。

针对火龙果果实病害防治，目前有采用化学防治[11]、生物防治[12]和天然产物防治[13]等方法，但仍以化学防治为主。因化学农药具有高效、快速、方便的特点，人们在防治病害过程中高频使用化学农药，从而使病原菌的抗药性增加，防治效果减弱，环境微生态失衡。另外，化学农药在田间及水果表面不能完全降解而导致的农药残留和环境污染等问题也日益严重，随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食品质量安全越来越重视，化学农药的问题也越来越受到关注。人们期待一种绿色、安全、环保的防治方法。而生物防治就是一种有效、安全的病害防治途径，也是未来病虫害防治的发展趋势。

水果储藏期病害的生防菌有多种，包括细菌[14]、放线菌[15]、霉菌[16]和酵母菌[17]等，但火龙果果实病害生物防治的研究较少。曾金兴等[18]利用解淀粉芽孢杆菌10075 拮抗2 株火龙果致腐菌，防腐效果高于30%。张振华等[19]从11 个不同生境分离出15 株具有拮抗活性的细菌，其中有2 株温室防效接近50%。陈迪等[20]发现7 株木霉菌对3 种火龙果病原菌均有一定的抑制作用。而未见利用放线菌防治火龙果储藏期病害的相关报道。本研究从发生软腐病的火龙果病果中分离纯化病原菌，利用形态学和分子生物学进行鉴定，以链霉菌为生物拮抗菌，研究其发酵滤液对火龙果软腐病的防治效果，以期为防止火龙果储藏期软腐病病害发生，提高储藏保鲜效果提供一定的理论基础和防控途经。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试火龙果 采自广东省湛江市麻章区金绿宝生态农场。选取新鲜健康、无机械损伤、大小和成熟度一致的新鲜红宝石火龙果，进行常规储存。储存期间挑选典型软腐病发病火龙果进行试验。

1.1.2 培养基 病原菌分离、纯化、活化和保存采用马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）。拮抗菌为本实验室保藏的拮抗放线菌， 皆为链霉菌属（ Streptomyces spp. ） ， 标记为LWL1827 、LWL1828、LWL1829 等共26 株。拮抗菌的活化、平板涂布和发酵液制备采用高氏一号培养基。

1.1.3 主要试剂和设备 dNTP 和LA Taq TM 聚合酶[宝生物工程（北京）有限公司]，ITS 和EF1-α引物（上海派森诺生物科技股份有限公司），Axyprep DNA 凝胶回收试剂盒[爱思进生物技术（杭州）有限公司]，Neofuge 13R 台式高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离鉴定 （1）病原菌菌株的获得。采用组织分离法，切取发病火龙果病健交界处3 mm×3 mm 的组织块，利用75%酒精和1%次氯酸钠溶液消毒，无菌水清洗，无菌滤纸吸干水分，置于PDA 培養基，28 ℃黑暗培养5～7 d。用竹签挑取边缘菌丝，划线纯化，经3 次继代培养后，接种于PDA 斜面培养基，4 ℃冰箱保存备用。

（2）病原菌致病性测定。采用无伤接种和针刺接种法。将健康火龙果清洗干净，75%酒精表面消毒。针刺接种：用灭菌竹签刺穿火龙果表面大约直径5 mm、深度5 mm 的伤口，将5 mm 病原菌琼脂块接种至伤口部位，置于无菌袋中，28 ℃培养。接种PDA 琼脂块为对照，重复3 次。不刺伤为无伤接种。定期观察接种处是否有病害发生，观察并记录病害发生时间及症状。对发病火龙果进行组织分离，根据柯赫法则确定是否为致病菌。

（3）病原菌形态特征观察。于PDA 培养基上观察病原菌菌落特征，如菌落形态、颜色、生长速度、菌丝形态等。插片法显微镜观察病原菌的显微特征，菌丝形态，大、小分生孢子产生情况及形态，厚垣孢子的有无和产生方式，产孢细胞类型等。参照《真菌鉴定手册》[21]进行鉴定。

（4）病原菌的分子鉴定。病原真菌rDNA-ITS及EF1-α 序列测定及系统发育分析，依照试剂盒说明书进行病原菌DNA 提取，分别用ITS 引物（ITS1： 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ） 和EF1-α引物（ EFl-728F： 5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'， EF1-986R： 5'-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3'）进行PCR 扩增，产物回收。委托上海派森诺生物科技有限公司进行序列测定，测序结果在NCBI 的GenBank 数据库进行BLAST 同源序列比对，选取同源性较高及形态相近的菌株序列， 经拼接后， 用MEGA7.0 中的邻接法（neighbor-joining， NJ）构建系统发育进化树，使用bootstraps 进行自检，1000 次重复以检验进化树置信度。通过亲缘关系分析确定病原菌的分类地位。

1.2.2 拮抗菌的拮抗防病作用 （1）平板抑菌试验。采用琼脂块法，用灭菌竹签从斜面试管中取少量放线菌，均匀涂布于高氏1 号培养基上，28 ℃培养7 d。用直径5 mm 的无菌打孔器打成菌饼，转接至涂布病原菌的平皿上，菌面朝下，重复3次，25 ℃培养3～5 d，观察，采用十字交叉法测定抑菌圈直径及抑菌圈透明度。

无菌发酵滤液的制备。将供试放线菌接种到液体培养基中，28 ℃、150 r/min 振荡培养9 d。发酵液4000×g 离心5 min 后，用0.22 μm 灭菌微孔滤膜过滤除菌，得无菌滤液。

抑菌率测定。采用生长速率法。将滤液配制成1∶1、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100（V/V）不同浓度上清液与PDA 培养基混合倒平板，以不加无菌滤液的PDA 培养基为对照。用5 mm 无菌打孔器取病原菌菌饼，置于PDA 平板中央，重复3 次，25 ℃培养7 d，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。确定最佳拮抗菌及滤液浓度，用于后续试验。抑制率=（对照菌落直径–处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

（2）火龙果接种试验。选取健康火龙果，经75%酒精和无菌水各擦拭3 次。选取对峙试验拮抗效果较好的拮抗菌株制备不同浓度的无菌发酵滤液，喷涂火龙果、晾干。将病原菌孢子悬浮液（孢子浓度为1.0×107 个/mL）喷涂火龙果，以空白培养基和清水为对照，3 次重复。处理火龙果室温3～11 d，每隔2 d 观察，计算病情指数（diseaseindex， DI）和防效（control efficacy， CE）。病情指数=（发病级别×该级别发病数）/（调查总个数×最高病级别）×100。防效=（对照病情指数?处理病情指数）/对照病情指数×100%。

判定标准[22]：无褐变为0 级；褐变面积小于20%为1 级；褐变面积在20%～50%之间为2 级；褐变面积在50%～75%之间为3 级；褐变面积大于75%为4 级；整果褐变为5 级。

火龙果经无菌滤液处理后，参考曹建康等[23]的方法对果实中多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性进行测定。

1.3 数据处理

利用Excel 2019 软件记录、统计数据并进行基础分析，采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析，采用Duncans 多重比较进行显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

从火龙果软腐病发病组织中分离获得病原菌，得到纯培养物标记为ZYW18。

2.1.1 病原菌的形态学分析 将病原菌ZYW18接种于PDA 培养基上培养观察菌落形态。发现培养至第3 天，菌落直径达到30 mm；第5 天菌落直径达50 mm；第7 天菌落直径达80 mm，菌落圆形，气生菌丝初期为白色，疏松，棉絮状，边缘具有卷毛状，逐渐变为浅黄色。菌落背面米黄色（图1A）。大型分生孢子罕见，镰刀状，中等偏窄，两端稍尖，略微向内弯曲，多数单隔膜，大小1.5～3.0 μm×20.0～30.0 μm。小型分生孢子呈链状排列，椭圆形或圆锥形，大小为5.0～12.0 μm×1.5～2.5 μm（图1B）。根据病原菌菌落形态和分生孢子特征，初步鉴定为镰刀菌属（Fusarium sp.）。

2.1.2 致病性测定 将病原菌ZYW18 回接于健康火龙果上，经无伤和针刺接种进行致病性测定（图1C）。发现2 种接种方法均出现症状。病原菌接种5 d 后病斑直径达到32.5 mm，果肉褐变，表层覆盖一层白色菌丝，后期菌丝范围逐渐扩大，果肉开始出现软烂，侵染部位组织软化褐变明显。症状与自然发病火龙果相符。从回接后的发病部位病健交界处取得组织块，分离得到病原菌与接种病原菌一致。证明接种的病原菌是引起火龙果软腐病的致病菌。

2.1.3 病原菌的系统发育分析 病原菌菌株ZYW18 的ITS 和EF1-α PCR 产物测序后，分别获得长度为540、590 bp 的扩增片段，产物纯化后测序，將rDNA-ITS 和EF1-α 基因序列提交到GenBank数据库（登录号分别为ON012775 和ON087601），经数据比对分析后构建系统发育树（图2）。ITS 序列聚类结果显示，ZYW18 与F. verticillioides LAPEMI10.2015（ITS 和EF1-α 登录号分别为KR052812 和MG195125.1）相似度达99%～100%，遗传距离最小，聚为一类，支持率为99%。结合形态特征和分子鉴定结果，表明引起火龙果软腐病的病原菌为串珠镰刀菌（F. verticillioides）。

2.2 拮抗性链霉菌对病原菌的拮抗作用及防效

2.2.1 拮抗作用 在PDA 平板涂布接种病原菌ZYW18，接种拮抗组织块，筛选拮抗菌株（图3，表1）。由表1 可知，26 株拮抗性链霉菌中，抑菌效果较明显的有5 株。其中抑菌圈直径较大，抑菌效果较明显的菌株为LWL1827，抑菌圈直径为（18.32±2.13）mm，且抑菌圈透明，抑制彻底，与其他菌株相比差异显著；其次为LWL1828，抑菌圈直径为（12.55±1.56）mm 。LWL1829 和LWL1818 抑菌不彻底，抑菌圈不透明。

5 株菌不同浓度的无菌发酵滤液对病原菌ZYW18 的抑菌作用见表1。由表1 可知，抑菌率最高的为LWL1827，1∶5、1∶10、1∶50（V/V）不同浓度无菌发酵滤液的抑菌率分别为91.23%±3.11%、87.21%±3.22%、和80.22%±2.03%，与其他菌相应浓度相比差异显著；其次为LWL1828，其浓度为1∶10 的抑菌率最高，为45.03%±1.98%；其他3 株菌抑菌效果相当，抑菌率相对较小。抑菌效果最弱的是LWL1829。

由图3 和表1 的拮抗试验可知，对病原菌ZYW18 的拮抗效果最佳的为链霉菌LWL1827（Streptomyces sp. LWL1827），选取1∶5、1∶10、1∶50（V/V）不同浓度进行火龙果接种试验。

2.2.2 防治效果 喷涂菌株LWL1827 的发酵滤液后，常溫储藏3、5、7、9、11 d。不同浓度和不同时间的火龙果病情指数（DI）和防治效果（CE）均有差异（表2）。不同储藏时间的培养基对照和清水对照的病情指数相当，差异不显著。由表2 可知，储藏3 d，处理和对照火龙果均未发病；储藏5 d，培养基对照和清水对照火龙果的病情指数分别为26.30±1.95 和23.70±4.23，显著高于LWL1827 发酵滤液处理的病情指数，浓度为1∶10 的防治效果较好，为53.59%±4.21%；储藏7 d 和9 d 的病情指数也显著低于培养基对照和清水对照；储藏11 d，培养基对照和清水对照火龙果病情指数已分别高达85.11±5.36 和82.55±6.43，滤液处理的病情指数均低于50.00%，浓度为1∶50的防治效果最高为51.54%±3.06%，其次是浓度为1∶10 的防治效果43.06%±2.88%。可见，随着储藏时间延长，拮抗菌株发酵滤液处理的火龙果病情指数均显著降低。同时，不同稀释度发酵滤液的防病效果亦有所下降，其中浓度为1∶10 的防治效果下降幅度较小。

2.2.3 拮抗菌株对火龙果抗性酶活性的影响 火龙果经浓度为1∶10 的拮抗菌株LWL1827 发酵液处理不同时间后，火龙果果实的抗性酶活性变化见表3。由表3 可知，3 种抗性酶PPO、POD和PAL活性均呈先逐渐上升，后逐渐下降的趋势，与对照相比差异显著。第7 天3 种酶活性均达峰值，PPO、POD 和PAL 活性分别为（1.90±0.15）、（3.88±0.55）、（1.48±0.43）U/g。由表中还可看出，菌株LWL1827 发酵滤液处理后火龙果3 种抗性酶活性均高于对照。对于PPO，储藏9 d 和11 d的酶活性分别是对照的2.31 倍、2.28 倍；对于POD，储藏7 d 的酶活性是对照的2.34 倍；对于PAL，储藏3、5、7、9、11 d 的酶活性分别为对照的1.85 倍、2.20 倍、2.43 倍、2.79 倍、2.80 倍。可以看出，滤液处理后抗性酶活性的下降变缓。

3 讨论

软腐病作为火龙果储藏期重要病害，是火龙果采后腐烂的主要原因，严重影响火龙果的储运品质，缩短货架期，造成较大经济损失。火龙果软腐病病原菌的鉴定，以及该病害的生物防治对于火龙果储运和绿色保鲜具有重要意义。

镰刀菌（Fusarium spp.）是真菌中的一个庞大的家族，普遍存在于土壤及动、植物有机体内，世界各地均有分布，是危害最严重的植物病原真菌[24]。一种镰刀菌往往可侵染不同种的植物，同种植物某种病害也会由于植物产地和来源不同，环境的差异，由不同镰刀菌侵染，或者不同优势种的镰刀菌复合侵染。本研究由火龙果软腐病患病组织中获得病原菌为串珠镰刀菌（F. verticillioides）， 不同于文献中尖孢镰刀菌（ F. oxysporum）[9]和木贼镰刀菌（F. equiseti）[10]，其原因可能是产地和来源不同，侵染的镰刀菌或优势种不同所致。

串珠镰刀菌是赤霉属的重要植物病原真菌，可侵染农作物、果树、蔬菜、花卉等100 多种植物，引起根腐、茎腐、果腐等多种症状，造成严重的经济损失[25]。串珠镰刀菌还可产生多种毒素，污染食品、饲料，危害人和动物健康和安全[26]。已有串珠镰刀菌侵染苹果[27]、西瓜[28]、香蕉[29]等的报道，而未见侵染火龙果的相关报道。本研究通过形态学鉴定和分子鉴定，将火龙果软腐病病原菌ZYW18 确定为串珠镰刀菌（F. verticillioides），为首次报道。菌株ZYW18 在PDA培养基常温培养7 d ， 菌落直径即可以达到80 mm，严重缩短火龙果的保鲜期。

在植物病害生防菌的研究和应用中，放线菌因其资源丰富，拮抗活性次级代谢产物种类繁多，使其具有巨大的开发潜力。链霉菌属（Streptomyces spp.）为放线菌科中最大的一个属，在土壤、植物根际、根内均有分布，是天然活性物质的重要来源。链霉菌能够产生多种抗生素和酶类，对病原菌具有拮抗作用[30-32]。另外，链霉菌还可以提高植物体内抗性酶的活性，降低丙二醛含量，提升脯氨酸和可溶性蛋白质含量，提高植物对外界环境的抗性[33]。张凯等[34]研究发现栗褐链霉菌（S. badius）对芒果炭疽病病原菌胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）具有较强的抑制作用，对染病果实有良好的防效。傅雁辉等[35]发现链霉菌JD121 能增强柑橘抗病性，降低腐烂率，提高保鲜效果。而尚无利用放线菌，尤其是利用链霉菌对火龙果软腐病进行生物防治的相关报道。本研究筛选得到链霉菌LWL1827，经平板抑菌试验发现该菌株拮抗效果较好。将LWL1827发酵滤液经不同浓度稀释后处理火龙果，发现浓度为1∶10 的发酵滤液能降低火龙果软腐病的病情指数，提高防治效果。同时，浓度为1∶10 的发酵滤液可以提高火龙果抗性酶活性，从而提高其抗病能力。本研究表明菌株LWL1827 及其发酵液产生的抑菌物质可以抑制病原菌的生长，同时可以提高火龙果抗性酶活力，使火龙果软腐病病斑的发展得到控制，提高了火龙果对病原菌的抵抗能力，降低了病情指数，提高了防效。因此，可将浓度为1∶10 的LWL1827 发酵滤液喷涂于火龙果果实表面，作为火龙果储藏期间软腐病的防治措施。但因火龙果主要用于食用，拮抗菌LWL1827 及代谢产物的毒理学、生物安全性有待进一步研究。平板抑菌试验可以直观地反映病原菌与拮抗菌的相互作用，表现拮抗菌抑菌能力的强弱，作为初步筛选的依据，但其忽视了拮抗菌-病原菌-植物三者的相互作用。通过火龙果接种试验可以更全面地体现三者互作，更准确地检验拮抗菌的拮抗能力。本研究利用拮抗菌发酵液对病情指数、防效和抗性酶活性的影响，体现了拮抗菌作用于病原菌和火龙果果实，对二者均产生作用。但拮抗菌、病原菌与火龙果间的互作机理有待进一步研究。