槟榔新拟盘多毛孢叶斑病菌的鉴定及生物学特性

李晶 谢开泽 张超 谢昌平

关键词：槟榔；叶斑病；新拟盘多毛孢；鉴定；生物学特性

槟榔（ArecacatechuLinnaeus）是棕榈科、槟榔属的多年生常绿乔木。它含有丰富的药理功能，对人体的多种系统具有一定调理作用，与益智仁、砂仁和巴戟天统称为中国四大南药，且槟榔居于首位。槟榔是湿热型阳性植物，喜高温、多雨，原产于热带太平洋地区和东南亚地区。2020年海南省的槟榔种植面积约12.47万hm2[1]。近年来，随着槟榔种植面积的逐渐扩大，槟榔的病害发生率也越来越高，严重影响槟榔的生长，制约着槟榔产业的发展。

目前，国内外已报道的槟榔叶片上的病害有Colletotrichumgloeosporioides、C.cordylinicola、C.fructicola、C.siamense、C.tropicale、C.arecicola和C.karstii引起的炭疽病[2-5]、由Capnodiumsp.、Meliolacamelliae和Acroconidiellaarecae引起的煤烟病[6-7]、由Phomopsispalmicolaf.arecae、Macrophomasp.、Phyllosticaaecae、Pestalotiapalmarum、Diaporthelimonicola和Curvulariapseudobrachyspora引起的叶斑病[8]、由Corynesporaelaeidicola和Cercosporaarecacearum引起的褐斑病[9]，由Cuignardiaarecae引起的灰斑病[5]，由Cephaleurosvirescens引起的藻斑病[10]，由Xanthomonascampestrispv.arecae引起的细菌性条斑病[11]，由Burkholderiaandropogonis引起的细菌性叶斑病[12]等。

在海南省儋州市檳榔种植基地病害调查中发现一种为害槟榔叶片的叶斑病，该病害发生初期叶片上产生黑褐色小病斑，发病后病斑中央白褐色，病斑上散生众多黑色小点，最终叶片干枯、倒垂，严重时导致叶片枯死，影响植株的光合作用，严重影响槟榔的产量和质量。因此，本研究结合形态学特征和多基因联合建树分析对该病原菌进行鉴定，并系统研究该病原菌的生物学特性，为槟榔叶斑病的准确诊断及田间防控措施的制定提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病株采集2021年3月，在海南省儋州市那大镇大星大队农场槟榔种植基地（109°4567.02N，19°6077.54E）采集具有典型症状的病叶，并对槟榔发病植株的症状进行描述和拍摄。

1.1.2主要试剂DNA快速抽提试剂盒（OMEGABIO-TEK）、DNA片段回收试剂盒、Taq酶、DNAMarker和通用引物[13]（表1）。参照《植病研究方法》和《植物病理学实验技术》[14]制备试验所需培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养（PDA）、马铃薯蔗糖琼脂培养（PSA）、麦芽浸膏培养基（MEA）、胡萝卜琼脂培养基（CA）、察氏培养基（Czapek）、大豆琼脂培养基（SGA）、玉米粉培养基（CMA）和水琼脂培养基（WA）8种培养基（表2）。

1.2方法

1.2.1菌株的分离与纯化采用组织分离法对采集的病害标本进行菌株分离。用自来水将具有典型症状的发病叶片清洗干净，于病健交界处剪取5mm×5mm的组织块，先用75%酒精消毒30s，再用2%NaClO消毒1min，最后用无菌水冲洗30s（重复3次），晾干，置于PDA培养基上，28℃光照培养，待菌落产孢后，制备孢子悬浮液，挑取单孢获得纯化菌株，纯化后的菌株转入PDA斜面试管，于4℃保存，备用。

1.2.2致病性测定用无菌接种针刺伤和无伤在健康槟榔叶片进行致病性测定。分离菌株在PDA培养基上28℃、24h光照培养7d后，将直径为5mm的菌饼接种到刺伤的槟榔叶片上，以直径为5mm的无菌琼脂块作为对照，表面覆盖吸水的灭菌纸，保湿培养7d，每个处理3片叶，3次重复。

观察并记录发病情况，待叶片发病，再次对发病部位进行菌株分离纯化和鉴定[15]。

1.2.3病原菌形态学鉴定将纯化后的菌株转接到PDA培养基上，于28℃培养7d，观察记录菌落的形态、颜色、大小及气生菌丝发达程度。待菌落产孢后，显微镜下观察分生孢子的形态特征，测量记录分生孢子的长宽、有色胞的长度、各个分隔细胞长度、顶端附属丝的数量以及顶端附属丝和基部附属丝长度。

1.2.4病原菌分子生物学鉴定将分离纯化的菌株置于28℃、24h光照培养7d，刮取气生菌丝100mg，按照真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（OMEGABIO-TEK）说明书提取菌株DNA，选择通用引物[13]（表1）进行PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，产物经纯化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序[16]，将所得序列在NCBI网站数据库中进行BLAST比对，并提交序列至GenBank。下载GenBank中已报道的其他相关病原菌序列，以ITS-TUB-TEF顺序用SequenceMatrix程序对序列进行首尾拼接，并通过MEGA7.0软件采用Maximumlikelihood法以NeopestalotiopsisclavisporaBRIP70210作为外群，构建系统发育树。

1.2.5生物学特性分析（1）培养基对菌丝生长的影响。将直径为5mm的菌饼接种于上述8种培养基平板上，于28℃培养箱中黑暗培养，每个处理3次重复。5d后采用十字交叉法测量菌落直径。

（2）温度对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。①菌丝生长。将直径为5mm的菌饼接种于PDA平板上，分别置于10、15、20、25、28、30、32、35℃培养箱中黑暗培养，每个处理3次重复。5d后采用十字交叉法测量菌落直径。②分生孢子萌发。采用悬滴法，将分生孢子制成浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液，滴于涂有PDA培养基的载玻片上，分别置于10、15、20、25、28、30、32、35℃培养箱，保湿黑暗培养，每个处理3次重复。7h后镜检并计算孢子萌发率。

（3）pH对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。①菌丝生长。用1mol/LHCl和1mol/LNaOH溶液调配pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基，将直径为5mm的菌饼接种于PDA培养基平板上，于28℃黑暗培养，每个处理3次重复。5d后采用十字交叉法测量菌落直径。②分生孢子萌发。用1mol/LHCl和1mol/LNaOH溶液调配pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基，将孢子悬浮液滴于涂有调好pH的PDA培养基的载玻片上，置于28℃培养箱黑暗保湿培养，每个处理3次重复。7h后镜检并计算孢子萌发率。

（4）光照对菌丝生长的影响。将直径为5mm的菌饼接种于PDA培养基平板，分别置于24h光照、12h光暗交替和24h黑暗3个光周期的28℃恒温培养箱内，培养5d，采用十字交叉法測量菌落直径，每个处理3次重复。

1.3数据处理

使用SPSS和Excel软件分析试验数据，使用AdobePhotoshopCS6软件处理拍摄的图片。

2结果与分析

2.1田间症状

2021年3月，在海南省儋州市槟榔种植基地发现槟榔叶斑病病株，该病害发病于槟榔叶片。发病初期，叶片上产生黑褐色小病斑，病斑近圆形或不规则形，病斑略有凹陷，环绕淡黄色晕圈（图1A）；发病中期，小病斑增多且不断向叶片两端扩展，病斑中央黑褐色，边缘浅褐色并带有黄色晕圈（图1B，图1C）；后期病斑中央浅褐色，其上散生众多黑色小点，即分生孢子堆，病部边缘深褐色（图1D），最终导致叶片干枯、倒垂。

2.2菌株的致病性测定

从采自海南省儋州市那大镇大星大队农场槟榔种植基地的10份具典型叶斑病的槟榔叶片上分离出3种不同的真菌菌株，经纯化后得到菌株HNDZAC-1、HNDZAC-2和HNDZAC-3。

采用刺伤和无伤接种的方法将这3株菌株分别接种到活体健康的槟榔叶片上。刺伤接种HNDZAC-1菌株的叶片3d后，槟榔叶片开始发病，接种部位出现浅棕色病斑，边缘具黄色晕圈，并逐渐向四周扩展；接种5d后，病斑中央坏死，边缘呈棕色并带有黄色晕圈；7d后，发病部位产生大量黑色分生孢子堆，与田间症状相同（图2A，图2B），发病率均为100%。无伤接种和对照组均未发病（图2C，图2D）。从病斑处再次分离纯化的菌株与接种菌株菌落形态特征相同，符合柯赫氏法则。而接种HNDZAC-2和HNDZAC-3菌株的叶片均未发病。结果表明菌株HNDZAC-1是槟榔叶斑病的致病菌。

2.3病原菌的形态学观察

菌株在PDA培养基上培养7d后菌落白色，边缘不整齐，菌落直径8.5～8.7cm（x=8.6cm），菌株的菌丝浓密，气生菌丝发达，菌落背面有浅黄色色素沉积，且菌落具环状同心轮纹（图3A）。30d后在PDA培养基上菌株的分生孢子堆产生于菌丝层表面或埋生于培养基底层，呈黑色墨汁状，单生或成簇聚集（图3B，图3C）。分生孢子梗退化为产孢细胞，产孢细胞无色透明，光滑，壁薄，圆筒形至安瓿瓶形（图3D，3E）。分生孢子4分隔，分隔处缢缩，拟纺锤形，直立，18.3～28.6μm×5.1～7.6μm（x=23.1μm×6.4μm）；基部细胞倒圆锥形或倒三角形，壁薄，光滑，长2.5～6.1μm（x=3.6μm）；中间3个有色胞异色，长12.1～17.8μm（x=14.4μm），似瓮形，隔膜及周壁颜色较其他部分深，基部向上第二细胞浅棕色，长3.0～5.7μm（x=4.3μm）；第三细胞深棕色，长3.8～5.0μm（x=4.4μm）；第四细胞淡棕色，长3.6～5.4μm（x=4.5μm）；顶端细胞无色透明，钝三角形，壁薄而光滑，长3.9～5.2μm（x=4.4μm）；有2～3根管状顶端附属丝，从顶端脊处产生，不分枝，15.9～29.2μm（x=22.8μm）；具1根基部附属丝，中生式，丝状，不分枝，长2.4～7.0μm（x=4.6μm）（图3F～图3I）。根据上述形态特征，可初步判断引起槟榔叶斑病的病原菌为新拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsissp.）。

2.4病原菌的分子鉴定

提取病原菌HNDZAC-1的DNA，进行PCR扩增病原菌ITS、TUB和TEF的基因序列，经PCR反应并用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，经测序后得到基因长度分别为527、453、275bp的序列（图4）（GenBank登录号分别为ON323485、ON323486、ON323487）。将得到的序列在GenBank中进行比对，并对3个基因序列联合构建系统发育树。结果显示：菌株HNDZAC-1与N.sonnerataeMFLUCC17-1745聚为一个进化分支，自举支持率为98%（图5）。因此，根据形态学鉴定和系统发育分析，将引起槟榔叶斑病的病原菌鉴定为N.sonneratae。

2.5病原菌生物学特性

2.5.1培养基对病原菌菌丝生长的影响病原菌在8种不同培养基上培养的菌落均为白色，边缘整齐。在PDA、PSA和MEA三种培养基上的气生菌丝发达，CA和Czapek培养基上的气生菌丝较发达，SGA和CMA培养基上的气生菌丝不发达，在WA培养基上的气生菌丝极不发达；病原菌在8种培养基上培养5d均无分生孢子产生（图6）。菌丝在CA培养基上生长速度最快，其次是PDA培养基，生长最慢的是Czapek培养基（图7）。

2.5.2温度对菌丝生长和分生孢子萌发的影响病原菌的菌丝在10～35℃下均能生长，当温度为10～28℃时，菌丝生长速率随温度升高而增大，其中，在28℃时菌落生长速度最快，菌落直径达6.49cm。当温度为28～35℃时，随温度的增加菌落生长速度明显减缓（图8）。

病原菌分生孢子萌发的适宜温度为20～32℃；在10～28℃范围内，分生孢子萌发率随温度升高而升高；当温度为28℃时，分生孢子萌发率最高，可达97%；在28～35℃范围内，分生孢子萌发率随温度升高而降低；温度高于35℃时，分生孢子不能萌发（图8）。

2.5.3pH对菌丝生长和分生孢子萌发的影响在pH为3～10时病原菌菌丝均可生长，菌丝适宜生长pH为5～8，且各pH下菌丝生长速率无显著差异，当pH为5时，菌落生长速度最快，直径达7.14cm，pH为11时，菌落停止生长（图9）。因此偏酸性生长条件更适合该病原菌生长。

分生孢子在pH为3～11时均能萌发。当pH≤2时，孢子不能萌发；pH为2～6时，随着pH的增大孢子萌发率逐渐增高；pH为6时，分生孢子萌發率达到最大，可达99%；pH为6～11时，随着pH的增大孢子萌发率逐渐降低（图9）。结果表明弱酸性至中性的条件更适合孢子的萌发。

2.5.4光照对病原菌菌丝生长的影响在24h光照条件下菌落生长速度最快，菌落直径为7.20cm；光暗交替次之，菌落直径为6.86cm；24h黑暗条件下菌落生长速度最慢，菌落直径为6.51cm（图10）。由此可见，光照有利于菌丝的生长。

3讨论

MARARACHCHIKUMBURA等[17]通过形态学和多基因分析将类拟盘多毛孢真菌分为Pestalotiopsis、Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis三个不同属，Neopestalotiopsis与其他2个属的主要区别是中间3个有色胞异色，然而，通过形态学特征无法准确鉴定病原菌，需要结合ITS、TUB和TEF多个核苷酸序列建树将病原菌进行准确分类。本研究通过病害田间症状观察、致病性测定、病原菌形态学及分子生物学鉴定，将引起槟榔叶斑病的病原菌鉴定为N.sonneratae。由N.sonneratae引起植物病害的报道较少，目前仅有在杯萼海桑（Sonneratiaalba）的叶片上引起叶斑病的报道[18]。本研究中病原菌株的分生孢子长度和宽度小于NORPHANPHOUN等[18]的研究结果；而且本研究中顶端附属丝只有2～3根，NORPHANPHOUN等[18]的研究有1～3根；但本研究中分生孢子的顶端附属丝和基部附属丝的长度均长于NORPHANPHOUN等[18]的研究结果。二者的分生孢子大小、顶端附属丝和基部附属丝的长度及顶端附属丝的数量存在差异，其原因可能是寄主和采集地不同，导致病原菌的分生孢子形态产生差异。

研究N.sonneratae真菌的生物学特性，对于该病原菌的田间防治策略的制定、药剂对真菌靶向抑制机理的研究及杀菌剂对该病原菌的抑制效果及作用机制的研究等有着重要的意义。本研究表明，该病原菌菌丝生长的温度范围广，在10～35℃下菌丝均能生长，最适生长温度为28℃，菌丝生长适宜pH为5～8，最适pH为5；分生孢子萌发的适宜温度为20～32℃，在28℃时，分生孢子萌发率最高，分生孢子萌发的适宜pH为4～8，最适pH为6；光照条件有利于病原菌菌丝的生长。通过生物学特性研究可知，病原菌的生长和分生孢子萌发的适宜pH均在5～8之间，高温高湿、强光照有利于该病的发生及传播，此外，夏季高温是引起槟榔病害的一个主要原因，因此，在种植槟榔时，可以适当调整土壤的pH，选择靠近水源的区域，并留有适当的树木庇荫，减少因高温引起的日灼，以减轻病原菌的侵入。另外，长期施用单一农药也会引起病原菌产生耐药性，所以在化学防治时，要注意根据田间实际情况混用或交替使用或不使用农药，才能取得最佳的防治效果。本研究明确了N.sonneratae菌丝生长和分生孢子萌发的最适条件，有利于认识该病害的发生发展规律，为防治槟榔叶斑病提供一定的理论依据。