乳酸及代谢在生殖疾病中的作用研究进展

段子博 张可心 李博 代亚利 林晓华 边文会 李艳青

乳酸,也称为2-羟基丙酸,一直以来都被认为是糖酵解过程中产生的代谢废物,但已有许多研究证实乳酸在多种细胞过程中起着关键作用,包括在能量调节、免疫耐受性、伤口愈合、癌症发展等方面[1]。近期研究发现,在胚胎植入过程中也会产生大量的乳酸,并且乳酸在其中发挥着重要的作用。

一、乳酸代谢的生理过程

葡萄糖是维持人体生命活动的重要物质之一,人体主要通过糖酵解、磷酸戊糖途径和氧化磷酸化三种途径来利用葡萄糖。通常仅在缺氧的情况下,机体才启用糖酵解途径。在有氧条件下,哺乳动物细胞内存在着巴斯德效应,即氧可以降低糖类的分解代谢和减少糖酵解产物的积累[2]。在糖酵解过程中,葡萄糖转运蛋白将葡萄糖转移到细胞中,然后在6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶等相关酶的催化作用下转化为丙酮酸。有氧条件下,丙酮酸通过三羧酸循环被完全氧化产生大量的ATP,而缺氧条件下丙酮酸则在乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)催化下生成乳酸[3]。乳酸有D-乳酸和L-乳酸两种形式,都是通过LDH转化而成[4]。因LDH存在异构体特异性,所以D-乳酸的转化需要通过D-LDH,L-乳酸则需要通过L-LDH转化[5]。由于人类细胞仅含有L-LDH,因此在人类中产生的乳酸几乎都是L-乳酸[4-6]。

当细胞进行糖酵解时,为避免细胞内积累导致负反馈抑制糖酵解过程,需要将细胞中产生的乳酸运输到细胞外部[7],同时以乳酸作为能量底物的细胞需要将细胞外乳酸运输到细胞中[8]。乳酸转运主要依靠一羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporter,MCT)和G蛋白偶联受体81(G-coupled protein receptor,GPR81)完成。MCT最常见的类型是MCT1和MCT4,其中MCT1在肿瘤细胞中表达,是乳酸的高亲和力转运蛋白,其主要功能是将细胞外乳酸运输到细胞中[9],但在缺氧条件下,MCT1也可以介导乳酸从细胞内运出[10]。MCT4主要在高度糖酵解细胞中表达,是乳酸的低亲和力转运蛋白,负责将乳酸从细胞内运出,MCT4的表达受缺氧作用的调控,缺氧诱导因子1α(HIF-1α)可以上调MCT4的表达以促进乳酸输出[9]。GPR81在大多数肿瘤中高度表达,生理浓度的乳酸就可以激活GPR81在肿瘤存活、转移和血管生成等活动中发挥作用[11]。

二、乳酸代谢与妊娠

在胚胎植入前,哺乳动物的胚胎代谢发生了巨大的变化。在形成桑葚胚前,胚胎对能量的需求较低,此时胚胎的能量主要来源于丙酮酸的氧化。随着胚胎的发育,葡萄糖的消耗量逐渐增加[12],当发育到囊胚阶段时,葡萄糖则成为主要的营养物质,存活的囊胚表现出高水平的葡萄糖摄取[13]。在小鼠和人囊胚中,超过50%的葡萄糖在有氧条件下转化为乳酸,而没有被氧化消耗[14-15]。这种在有氧条件下葡萄糖转化为乳酸的特殊过程由Warburg首次提出,因此被称为瓦氏效应(Warburg effect),也称作有氧糖酵解[16]。最开始瓦氏效应被认为特定存在于某些肿瘤中,而后证实某些如淋巴细胞这类快速增殖的细胞也具备此特点[17]。保守估计,在植入前后小鼠和人类囊胚每胚胎每小时将分别消耗约50～320 pmols葡萄糖,其中消耗的90%葡萄糖的将形成乳酸[18]。无论是常氧条件还是缺氧条件下,在囊胚中检测Hk2(hexokinase 2)、Pkm2(pyruvate kinase M2)、Pdk1(phosphoinositide dependent protein kinase 1)及LDHA等糖酵解相关基因的表达并无差异[19]。在胚胎植入的过程中,由于植入部位缺乏母体血管而形成相对缺氧的环境,低氧条件将激活的缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α),并且研究表明HIF-1α能推动小鼠胚胎干细胞完全依靠糖酵解来获取能量[20]。在囊胚晚期和早期胚胎植入阶段,LDH亚型从有利于丙酮酸形成的LDHB亚型转变成有利于乳酸形成LDHA亚型,这也与肿瘤细胞侵袭的特点相同[21-22]。以上都表明在囊胚中存在着瓦式效应并产生大量乳酸。在人类和其他哺乳动物中,胎儿循环中的乳酸水平显着高于母体循环[29]。因此乳酸可能作为一种能量来源用于各种胎儿组织的发育,与其在肿瘤发展中起着相同的作用。

胎盘中也存在着有氧糖酵解,葡萄糖在胎盘中被代谢产生的乳酸,是胎儿的生长的关键能源[23]。在小鼠蜕膜细胞中,黄体酮通过PI3K/Akt信号通路激活HIF-1α以维持有氧糖酵解产生大量的乳酸[24]。在蜕膜免疫细胞中,活化的巨噬细胞、树突状细胞和T细胞的一个重要特征就是细胞从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解[25-26],并且在淋巴细胞中也发现了增强的有氧糖酵解在特定时期产生乳酸[17]。因此,囊胚、胎盘和蜕膜免疫细胞可能在妊娠早期通过有氧糖酵解产生大量的乳酸,在母胎界面创造一个细胞外低pH值的微环境。

此外,在健康育龄妇女的阴道中也发现大量乳酸,在参与阴道的抗菌和免疫调节,优化上皮细胞功能,维持妊娠延长至足月等方面发挥作用[27]。

三、乳酸促进胚胎着床的机制研究

乳酸通过促进子宫内膜细胞蜕膜化、促进子宫内膜细胞外基质降解、诱导血管生成、影响免疫调节等方式参与胚胎着床的过程。

1.乳酸促进子宫内膜细胞蜕膜化:在肿瘤细胞中乳酸可以作为代谢底物来满足其能量需求,例如在缺氧区域,肿瘤细胞通过MCT4排出乳酸,并在有氧区域通过MCT1摄取乳酸转化为丙酮酸,为需氧细胞氧化磷酸化提供燃料,从而为糖酵解的癌细胞节省可利用的葡萄糖[28]。在妊娠早期,未分化的蜕膜细胞也可以通过MCT1导入乳酸从而加速细胞增殖,并且抑制的乳酸转运会导致蜕膜化失败[24]。

2.乳酸促进子宫内膜细胞外基质降解:控制子宫内膜细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)的降解以促进滋养层的侵蚀是胚胎植入的关键过程之一[30],而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)则是降解ECM的关键蛋白酶。其中MMP-2和MMP-9在月经周期和怀孕期间的子宫内膜组织重塑中发挥着重要作用[31]。已发现在胶质母细胞瘤细胞中,乳酸可以通过上调转化生长因子β2(transforming growth factor-beta2,TGF-β2)表达来增强MMP2的水平,从而促进胶质母细胞瘤细胞的迁移[32]。在妊娠过程同样发现蜕膜组织中调节T细胞(regulatory T cells,Treg细胞)聚集并产生TGF-β[33],并且在植入期人子宫内膜腔上皮和腺上皮中也能发现TGF-β1和TGF-β2的存在[34]。由此推测乳酸可能通过增强子宫内膜细胞和Treg细胞产生TGF-β,从而增加MMPs的产生以促进ECM的降解。

囊胚创造的细胞外部低pH的微环境同样有利于MMPs的激活[35]。MMPs受内源性金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP)的调控,而MMP/TIMP的比值通常决定了ECM蛋白降解和组织重塑的程度[35]。已证明在髓核细胞中,低pH值使TIMPs的产生减少了90%,而基质金属蛋白酶的产生几乎不受影响。因此,低pH值使这些酶的相对活性出现不平衡也有利于促进ECM的分解[36]。

组织蛋白酶B也与哺乳动物囊胚细胞外分解ECM相关[37]。在小鼠滋养层细胞分化过程中,组织蛋白酶B和D的表达上调对于胚胎的正常发育和子宫蜕膜化是至关重要的。在早孕母羊子宫内膜中也观察到组织蛋白酶的表达上调,并且在母胎妊娠识别过程中活性增加。自1细胞到桑椹胚阶段组织蛋白酶B和D的表达水平很高,并且抑制组织蛋白酶的表达作用将阻止胚胎发育。因此组织蛋白酶家族,特别是组织蛋白酶B,在胚胎植入和发育中具有重要作用[38]。在许多癌症中都可发现组织蛋白酶B的表达升高,并且与患者的生存率密切相关,并有研究表明组织蛋白酶在酸性条件下最活跃,细胞周围低pH环境更有利于组织蛋白酶以活性形式释放[39]。由此推测在乳酸也可能通过上调组织蛋白酶B的表达而加速ECM的分解。

综上所述,乳酸形成的低pH值环境可能通过增加MMPs和组织蛋白酶的产生,从而促进子宫内膜组织ECM的分解,使胚胎能够顺利植入。

3.乳酸诱导血管生成:血管生成是正常着床和胎盘形成的关键组成部分,而血管成分在妊娠早期发挥着重要作用,许多蛋白酶,代谢物,离子,生长因子,细胞因子,基质蛋白都参与血管生成的过程。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种多功能因子,主要参与调节内皮细胞的增殖、分化和存活以及血管通透性[40]。研究发现VEGF在囊胚植入期间增多并作为子宫血管生成的关键调节因子[41]。TGF-β1蛋白参与母胎界面的精子发生、排卵、植入、滋养层细胞分化、血管生成和免疫调节等过程。体外研究表明,TGF-β1可以直接在脉络膜上诱导血管生成,也可以通过增加滋养层细胞中的VEGF表达间接诱导血管生成[41]。

乳酸诱导的酸中毒已被证明可以增加肿瘤细胞中VEGF的表达而刺激内皮细胞迁移,并且能促进VEGF活性形式的释放以刺激新血管的发育[18]。伤口愈合过程中乳酸可以诱导VEGF和TGF-β等介质的释放,从而刺激血管生成并促进伤口愈合[42]。因此推测乳酸可能通过肿瘤发展和伤口愈合中类似的机制来促进囊胚植入过程中血管的生成。

4.乳酸影响免疫调节:在肿瘤细胞中,活化的T细胞和NK细胞(natural killer cells)会通过有氧糖酵解产生乳酸,细胞内产生的乳酸依赖于浓度梯度排出到细胞外。因此肿瘤细胞产生的乳酸在细胞外积累进而抑制活化T细胞内的乳酸排出,乳酸在T细胞内积累减缓能量代谢并最终诱导抑制表型的形成[43-44]。并且乳酸通过抑制细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的增殖和细胞因子(Interleukin 2,IL-2和interferon-γ,IFN-γ)的产生来降低它们的细胞毒性活性[44]。因此囊胚产生的乳酸抑制T细胞的代谢和功能可能是调节胚胎植入中局部免疫反应的机制之一。

Treg细胞介导的免疫反应在维持妊娠和预防相关并发症中发挥着重要的作用,在孕妇血液、子宫及胎盘中可发现大量Treg细胞的积累[45],研究发现乳酸不会降低Treg细胞的增殖与免疫抑制作用[46],并且在乳腺癌细胞中乳酸还可诱导幼稚的CD4+细胞分化成Treg细胞[47],乳酸的积累将更有利于Treg细胞的存在和发挥功能。

胎儿-母体免疫耐受性的建立依赖Treg细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞的共同调节,TGF-β1在其中发挥着关键作用。TGF-β1通过诱导Treg细胞的产生和维持其免疫抑制功能,介导M1/M2巨噬细胞的平衡,并调节NK细胞的功能,从而参与维持胎儿-母体免疫耐受性[48]。与非孕女性相比,孕妇血清的TGF-β值明显升高[49]。在胶质瘤细胞中已证实,乳酸可以诱导细胞中TGF-β的表达增加[32],因此推测妊娠女性体内增加的TGF-β可能也与乳酸的积累有关。

在胚胎植入处还可发现大量的巨噬细胞,有人推测这有助于子宫内膜组织重塑以适应胚胎外组织增殖[50]。研究发现,在肿瘤细胞中乳酸是诱导巨噬细胞极化为具有下调免疫应答能力的M2样表型的信号,并且诱导了高水平的VEGF和精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的表达[51],这可能与巨噬细胞在胚胎植入中的作用机制一致。

四、乳酸与生殖相关疾病

多种生殖相关疾病都具有乳酸代谢异常的表现,对乳酸作用机制的研究有助于揭示此类生殖相关疾病的发病机制,指导疾病的治疗。

1.子宫内膜异位症是导致女性不孕的病因之一。有研究发现腹膜型子宫内膜异位症女性腹膜液中的TGF-β1水平和乳酸浓度较正常女性显着增加,并且乳酸浓度与腹膜液中TGF-β浓度呈正相关。TGF-β1可增加糖酵解途径中关键酶的表达和腹膜间皮细胞中乳酸的产生,为子宫内膜异位症细胞提供高能量代谢物,以促进子宫内膜异位症病变的发展。而乳酸同样可以激活潜伏的TGF-β1,可能形成TGF-β1和乳酸增加的正反馈回路。已有研究证明乳酸增加可以激活TGF-β配体从而诱导肌成纤维细胞分化,这可能与导致相邻腹膜或病变内的上皮发生间充质转变,再次促进异位子宫内膜细胞侵袭的机制相同。综上,腹膜组织和腹膜液内增加的乳酸可能有利于异位子宫内膜细胞的存活,植入并入侵腹膜,引起子宫内膜异位症的发生[52]。

2.胎盘代谢葡萄糖产生的乳酸是胎儿生长的关键能源,在滋养层细胞中,水通道蛋白9(aquaporin 9,AQP9)可能与单羧酸盐转运系统(MCT)一起作为乳酸的转运蛋白发挥作用。Yollyseth[53]等人通过研究提出先兆子痫中的增强的氧化应激可能会损害AQP9作为乳酸转运蛋白的功能,从而损害胎盘对乳酸的利用,促进更多活性氧的积累并对滋养层细胞的存活产生不利影响。滋养层细胞在此情况下可能会加强凋亡细胞的脱落,使其进入母体循环,从而导致以全身性的内皮功能紊乱为特点的孕产妇综合征。

3.多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种与代谢紊乱相关的原发性排卵功能障碍疾病。在正常卵巢中颗粒细胞通过糖酵解代谢葡萄糖产生乳酸和丙酮酸,其中产生的丙酮酸用于卵母细胞的能量来源,成熟的卵丘卵母细胞复合物(cumulus-oocyte complex,COC)消耗的葡萄糖和丙酮酸是未成熟卵母细胞复合物的两倍,随着COC成熟发展,葡萄糖、丙酮酸盐和氧气消耗也逐渐增加[54]。与年龄和体重匹配的正常女性相比,PCOS女性外周胰岛素介导的葡萄糖摄取减少了35-45%[55]。D.Maruthini[56]等人的研究证明卵巢颗粒细胞除了减少葡萄糖摄取外,还优先将葡萄糖转化为乳酸从而减少了丙酮酸的产生。由于涉及到卵母细胞发育和成熟的关键能量底物的丙酮酸产生减少,卵母细胞质量也受到负面影响。

在胚胎植入和发育过程中会产生大量的乳酸,研究证明乳酸不应被看作糖酵解的副产物,而应被视为胚胎植入中关键的信号分子并在这个过程中发挥着重要的作用。乳酸在母胎界面中的作用虽尚未明确,但基于胚胎植入与肿瘤发展中相似的生物学行为,可以推测出乳酸可能在促进组织分解中以利于胚胎植入,传递信号以促进血管生成,调节免疫以防止母体排斥反应等方面发挥作用。进一步研究乳酸在胚胎植入中的作用可以帮助我们深入了解更多妊娠相关疾病的发病机制,从而解决许多临床治疗中的问题。