SLC35A1 对猪流感病毒复制的影响

杨嵘长

(宽甸满族自治县动物疫病预防控制中心，辽宁 宽甸 118200)

为避免猪流感病毒对养殖区域造成较大的影响，需重视猪流感病毒复制病毒，在筛选宿主基因的基础上，寻找其中存在的SIV (结构投资载体) 对猪生命周期造成的影响，深入研究SLC35A1 对猪流感病毒复制产生的干扰，从而根据检测基因的方式，明确在自然环境下猪受感染的现象是如何产生的。 这样，本研究则可基于SLC35A1 对猪流感病毒复制的影响，为后续的致病机理奠定良好的基础。

1 猪流感病毒的基本概述

流感病毒隶属于正黏病毒科，其中的基因组主要分为单股负链RNA，具体大小被规划在12 ～14 kb，并且可以分为从A 到D 四种类型。此时，B 型、A 型内的基因组片段有8 个；D型和C 型之间的基因组片段有7 个。 而B 型的感染性更强，其可以对人类的身体健康造成影响，引发人类出现感染问题，严重则会造成呼吸系统等疾病的产生；C 型的流感病毒是以寄生为主，其宿主范围是猪和人。 在此基础上，可结合血清学、流行病学以及病理学等方面的研究进行分析，其中D 型的病毒主要是感染自然宿主，如牛等；A 型的流感病毒则可划分为病毒表层的NA (神经氨酸酶)、HA (抗原蛋白血凝素)[1]。

其中猪流感被认定为其中的A 型病毒，会引起猪出现发热、打喷嚏、厌食、流鼻涕、咳嗽以及呼吸困难等疾病。 在猪流感发生后一般在5 ～7 日内可以恢复正常，但由于此病毒的致死率高达4% ～10%并且具有较高的发病率，一旦猪流感发生则会造成较大的经济损失。 同时由于猪群在养殖过程中需控制屠宰体重，若发生猪流感猪的免疫力则会下降，引发其他的病毒的并发产生，如链球菌、巴氏杆菌、综合征病毒等，提高的猪的死亡率，无法保证猪养殖人员的经济效益[2]。

2 SLC35A1 对猪流感病毒复制的影响

2.1 配置实验材料及设备

2.1.1 材料 为监测SLC35A1 对猪流感病毒复制的影响，可选取正确的实验材料配置方式，运用固体培养基、液体培养基执行实验。选购8% 含量的polybrene，可选取粉末状的polybrene，让其在无菌的状态下将培养基内的离子水去除，保证其在充分溶解后能够定容在25 mL 的溶液中，将其保存于4 ℃以内，确保在实验过程中相关材料试剂不会出现问题。

同时可选取50 × TAE 缓冲液，让其能够注入于800 mL 的离子水内运用充分的搅拌方式，注入对应的醋酸，在确保相互之间能够完全混合后，让其中的离子水能够定容到1 000 mL 并且在室温下进行保存。 另外，可增加甘氨酸电泳、转膜缓冲液等的应用，让其能够在室温条件下与盐酸进行混合，适量粉底增加爱甲醇，做好备用准备[3]。

2.1.2 设备 在进行实验过程中需运用摇床、多功能PCR 仪、生化培养箱(恒温)、冷冻离心机、显微镜、多功能酶标仪等设备[4]。

2.2 设置实验方法

2.2.1 细胞相关实验 从猪的身体中获取细胞，运用液氮容器对细胞进行冻存，在应用时直至液氮排净后则可将其应用于37 ～42 ℃的温水内。

同时若需将细胞进行冻存，可将无血清培养基中血清、DMSO 以及冻存液的比例控制在6∶3∶1，让细胞可以在4 ℃内的冰箱内进行预冷，将单层的细胞近悬浮，确保可以注入15 mL 的细胞悬浮液，在执行离心3 ～5 min后，则可将上清去除，将保存好的细胞进行沉淀，在实验环节将其进行取出。

再者，为保证细胞的计数工作能够顺利实施，需将盖玻片、计数板擦拭干净，在单层细胞密集的区域，确保单个细胞呈现出悬浮的状态，根据实验要求吸出对应的细胞，让其密度可以稀释到100 ～1 000 倍，这样，则可让悬浮液充满整个计数板和盖玻片以内，在完成3 分钟的静止后，则可运用“计上不计下，计左不计右” 的方式，完成对细胞的计算。

2.2.2 病毒相关实验 首先，通过病毒原液的应用，执行对应的灭菌操作，在PBS 稀释进行时候，则可运用无菌的注射器，将200 μL的病毒进行稀释，保证其可以利用绒毛尿囊腔完成接种工作，在此操作执行9 ～11 日后，则可运用石蜡进行封口，让其可以放置在37 ℃恒温箱中完成对应的孵化操作。 这样，在猪流感病毒增殖培养过程中，实验人员则可通过12 h 的观察，运用鸡胚胎来确认其是否存活，若在接种完毕后48 ～72 h 以内出现鸡胚死亡的现象，则可将其放置于4 ℃的环境中，在4 h以内完成离心操作，汲取其中的尿囊液并开展对应的离心操作，保证在上清收集完毕后，可进行高速的离心操作，让其能够进入滤器过滤，在确认病毒的滴度后，方可让其进入负80 ℃的环境下进行保存。

其次，可运用猪流感病毒细胞接种的方式，在细胞板内增加单层流感病毒的应用。 优先将病毒原液放置于无菌的环境中，让其能够进行稀释，保证可以运用无菌PBS 执行对细胞的二次清洗。 由此方式，适当地增加病毒液的应用，促使流感病毒能够在37 ℃内的培养箱中进行一个小时的孵化。 这样，在每孔内都已经完全弃去病毒液后，则可运用无菌PBS 洗液执行二次清洗操作，让青链霉素含量为1%，使其可以在现象的培养基内进行繁殖。

最后，可在37 ℃的室温内进行对猪流感病毒的培养，让实验人员可以根据不同的时间点对细胞的状态进行观察，运用收集上清的方式，合理地规划存活细胞数量。 这样，则可在96 孔微量的反应板上执行对应的操作。 实验人员通过左右孔内注入50 μL 生理盐水的方式，让病毒液能够与之混合，在二者充分融合后，方可将其中的50 μL 病毒液吸出，将其应用于第二个孔内，按照次序依次对其进行吸取。 在此基础上，则可将12 个孔内猪流感病毒的变化情况进行分析，运用12 孔内的阴性对照实验，保证不同孔内的细胞悬浮液可以自右至左进行排列。 据此，则可在稳定15 min 后按照操作需求，在激光显微镜下进行对应的观察操作，顺利检测出SLC35A1 对猪流感病毒复制的影响。

2.3 结果与分析

2.3.1 创建SLC35A1 敲除细胞系，抑制SIV增殖 SLC35A1 对猪流感病毒复制具有一定的增值影响，运用实验比对的方式可验证了12个准确的候选因素，一旦SLC35A1 被敲定，则可看出其对猪流感病毒复制产生的抑制作用，当猪已经感染流感病毒72 h 之后，细胞的存货数量相对较多，此时为创建出SLC35A1的细胞敲除体系，可基于NPTr -Cas9 细胞进行考虑，运用ALG5 的操作方式，在NPTr -Cas9 的基础上构建对应的SLC35A1 敲除细胞组。 这样，则可结合实验中4 株单克隆细胞，让其他病株不会受到影响，运用野生型的对照方式，在36 小时后测定4 株单克隆细胞所受到的抑制性作用。 得出结果，在第3、第4 株单克隆细胞对猪流感病毒的增殖细胞抑制作用作为强烈。 同时为印证SLC35A1 对NPTr -Cas9 的影响，需将 SIV 划分为 NPTr -ΔSLC35A1 以及NPTr -Cas9，通过12 h、24 h以及36 h 的试验对比方式，正确地收集存活细胞及上清。 经实验表明，前者可表达为通过蛋白定量检测的方式，展现出其中涵盖的NP蛋白表达量，而后者内所检测出的病毒为TCID50。 据此，则可根据SLC35A1 敲除操作，了解在SLC35A1 应用后，其会对SIV 产生一定的抑制作用。

2.3.2 发挥SLC35A1 敲除作用，抑制猪流感病毒吸附 由于SLC35A1 作为一种唾液酸转运蛋白，其在生成过程中需要唾液酸进行合成，当出现猪流感病毒时，唾液酸会吸附于细胞的表面，运用HA 与细胞表层结合的方式，形成唾液酸。 在此背景下，可通过实验研究的方式，掌握SLC35A1 敲除后期是否能够对猪流感病毒的吸附造成影响。

通过NPTr - Cas9 细胞的复制，让其能够进行高速的冷冻以及浓缩，控制好SIV 的状态，让操作人员可以运用MOI ＝75 的剂量，实现SLC35A1 敲除细胞与SIV 的反应。 首先，可将病毒进行固定，在经过一段吸附时间后，运用依次发育的方式，执行显微镜与激光工具的观察。 经结果下显示，在野生型细胞内病毒会出现于细胞膜的附近，并且会在短时间内进行聚集。 但在SLC35A1 敲除细胞的观察过程中未发现明显的病毒颗粒。 据此，则可运用细胞比对的方式，掌握SLC35A1 于HA 之间存在无法结合的问题，表示当SLC35A1 敲除细胞系运行过程中，其会对SIV 造成一定的影响，了解到猪流感的产生是由于细胞表层与病毒颗粒的集合效率下降造成。

其次，在SLC35A1 敲除后，能够了解到HA 会产生一定的吸附抑制作用，其可以保证SIV 不会持续增殖。

2.3.3 开展SLC35A1 实验，调控猪流感病毒复制问题 通过凝集素实验的方式，印证SLC35A1 敲除过程中细胞表层所发生的唾液酸受阻现象，运用流式细胞术掌握细胞在敲除后细胞与HA 蛋白的结合量呈现出下降的趋势，由此则可判定SLC35A1 对猪流感病毒的抑制的作用。 通过3F -Neu5Ac 来对唾液酸的转移进行抑制，保证在细胞内猪流感病毒不会持续增殖。 由此方式，可运用SLC35A1 敲除的方式，证实了其对猪流感病毒复制产生的抑制作用。 即使未进行蛋白水平的检测，也可在72 h内掌握细胞存活阶段SLC35A1 敲除细胞系的状态。 据此，利用吸附实验的方式，实现对HA 蛋白的验证，运用有活性的猪流感病毒试验方式，了解到猪细胞增殖后，其中的病毒会产生浓缩，只有运用高剂量的SLC35A1 才可控制细胞的密度，抑制其中的F26、PR8 以及H9N2 毒株的增殖。

3 结论

综上所述，经过上述实验检验的方式，可得出猪流感具有较强的传染性，并且猪是流感病毒的一种混合器，一旦猪感染了猪流感则会产生新型的病毒，增强人感染流感的可能性。所以，为避免猪流感带来经济损失或是对人们的身体健康造成影响，应加强对猪流感病毒的控制，做好预防计划，保证流感病毒在整个细胞周期内都能得到控制，这样在网格蛋白接入环节，相关治理人员则可根据流感病毒进入细胞的状态，避免宿主因子与流感病毒进行重叠，从而运用通过替代筛选的方式降低宿主因子的实际表达水平，保证猪的健康成长，推动生猪养殖水平的不断提升。