基于网络药理学和动物实验探讨黄芪葛根汤治疗糖尿病肾病的作用

于官正，李 鸿，涂 星，刘音贝，罗 骞，张 燕

（1.湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000；3.广州医科大学附属第五医院药学部，广东 广州 510000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN） 是以白蛋白尿持续性排泄增加、肾小球滤过率下降、肾小球高滤过等为临床特征的糖尿病并发症，可导致终末期肾脏疾病（endstage renal disease，ESRD）［1-2］。DN 患者常伴食欲低下、倦怠乏力等症状［3］。临床治疗DN 常以一般治疗、药物治疗、透析治疗等手段，疗效欠佳且有一定副作用［4］，寻找恰当药物治疗DN 意义重大。中医认为DN 为消渴病变证，属于“尿浊” “水肿” 等范畴，病因病机为正气虚衰、脾失健运等［5］，治疗常以益气养阴、活血化瘀为主［6］。黄芪葛根汤始载于《证类汇补》，由黄芪、葛根组成，具有健脾益气、滋阴清热、生津止渴等功效，是治疗消渴的经典方［7］。研究发现，黄芪、葛根具有降糖作用，可应用于糖尿病及其并发症的治疗［8］，但具体药理机制尚不明确。

网络药理学将生物学与药物作用密切结合，可从整体上揭示复方对疾病的作用机制，与中医整体观念的主导思想相似［9］。本研究拟采用网络药理学技术预测黄芪葛根汤治疗DN 潜在核心靶点与通路，并采用高脂高糖饲料联合链脲佐菌素诱导建立DN 大鼠，给予黄芪葛根汤进行干预，深入挖掘其治疗机制，以期为临床治疗DN 提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 软件及数据库 基因综合表达 （GEO） 数据库（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）；中药系统药理分析平台（TCMSP，http：／／tcmspw.com／index.php）；中医药综合数据库（TCMID，http：／／www.megabionet.org／tcmid／）；中医药整合药理学研究平台（TCMIP，http：／／www.tcmip.cn／TCMIP／index.php）；Cytoscape （version 3.7.2）；Java （version 1.8.0）；Perl 语言 （Active Perl，version 5.30）；R 语言（x64 version 4.2.1）；Bioconductor 平台 （https：／／www.bioconductor.org）；STRING 数据库（http：／／string-db.org／）；Uniprot 数据库 （https：／／www.uniprot.org／）。各数据库的检索均于2022 年9 月29 日完成。

1.1.2 DN 差异表达基因的筛选 DN 基因载于GSE30122芯片，包括50 名健康者和19 名活动性DN 患者基因表达量，下载芯片平台文件及探针文件［10］。运用Perl 语言将探针名称转为基因名称并分为正常组与模型组。以正常组和模型组基因差异倍数绝对值（｜logFC ｜） ≥1、P＜0.05 为条件，运行R 语言筛选差异基因，绘制火山图及热图。

1.1.3 复方活性成分及靶点的预测 检索TCMSP 数据库，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥0.30、类药性（drug likeness，DL） ≥0.18 为条件筛选黄芪、葛根的有效成分［11-12］，Perl 语言筛选活性成分对应靶标；检索TCMID、TCMIP 数据库中黄芪、葛根的有效成分及靶点。通过Uniprot 数据库将靶点名翻译为基因名。

1.1.4 中药调控网络的构建 黄芪葛根汤靶点基因与DN差异基因取交集，绘制Venn 图。运行Perl 语言得到交集基因的有效成分及网络属性与结点属性文件，将所得作为输入文件导入Cytoscape 绘制中药调控网络并进行拓扑分析。

1.1.5 蛋白互作网络分析 将交集基因录入STRING 数据库，种属选择“Homosapiens”，隐藏游离蛋白，构建PPI网络，下载TSV 格式文件并通过R 语言运行，筛选富集数目排名前二十的核心基因。

1.1.6 GO 功能与KEGG 通路富集分析 通过R 语言对基因ID 进行转化编码，以P＜0.05 进行基因本体（GO） 功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG） 富集分析，P值越小富集越明显，GO 功能富集分析按P值从小到大选取排名前十的条目进行分析，不足10 条则分析全部；KEGG富集分析同法分析前20 条通路。

1.2 实验验证

1.2.1 动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠80 只，4 周龄，体质量（100±10） g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （辽） 2020-0001］，在温度（20±2）℃，相对湿度50%～60%，进食、饮水自由的环境下饲养，分笼适应性喂养1 周，生存状态良好。本实验经湖北民族大学生物医学科研伦理审查通过 （伦理号2022004）。

1.2.2 药物与试剂 黄芪葛根汤由黄芪36 g （批号210901）、葛根18 g （批号210801） 组成，药材购自湖北聚瑞生物科技有限公司，经湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心文德鉴副教授鉴定为正品。药材加8 倍量水浸泡后煎煮2 次，合并滤液，浓缩成生药量1 g／mL 的浓缩液。高脂高糖饲料（66.5%维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+1% 胆酸钠）、链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、柠檬酸一水、柠檬酸钠二水合物、盐酸二甲双胍（货号 MS1606-50KG、MS1601-500MG、MS5532-50G、MS5533A-50G、MZ3403-1G，上海懋康生物科技有限公司）；晚期糖基化终末产物（AGEs）、肿瘤坏死因子-α （TNFα）、血管内皮细胞粘附分子1 （VCAM-1）、单核细胞趋化蛋白1 （MCP-1）、核转录因子p65 （NF-κB p65） ELISA 试剂盒和DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒（货号ml002154、ml002095、ml002068、ml037840、ml058779、ml095670，上海酶联生物科技有限公司）。

1.2.3 仪器 631-B 型血糖仪［配i-sens631A 血糖试纸，欧姆龙健康医疗（中国） 有限公司］；BS-2000M 型全自动大型生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；LVEM5 型透射电子显微镜（美国Delong Instruments 公司）；DSX1000 型显微镜（日本奥林巴斯公司）；5810R 型高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；SCIENTZ-48 型高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；脱水机、包埋机、病理切片机、组织摊片机 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2.4 造模、分组与给药 大鼠适应性喂养1 周，随机分为正常组和造模组。造模组喂养高脂高糖饲料8 周后，用0.1 mol／L 枸橼酸缓冲液配制STZ，单次注射剂量为40 mg／kg，注射30 min 后正常喂养，每周1 次，连续3 周。FBG＞16.7 mmol／L、24 h 尿蛋白定量＞30 mg 则认为DN 大鼠模型造模成功［13］，共成模57 只，随机分为模型组10只，黄芪葛根汤低、中、高剂量组各12 只，盐酸二甲双胍组11 只。黄芪葛根汤的临床等效剂量为5 g／kg，以1／2、1、2 倍临床等效剂量为黄芪葛根汤低、中、高剂量［14］；盐酸二甲双胍的临床等效剂量为0.15 g／kg。各给药组固定时间段灌胃给药；正常组和模型组同法给予蒸馏水，每天1次，连续8 周。分别于给药前和末次给药24 h 后测定各组大鼠FBG （尾尖血）。

1.2.5 肾组织形态学观察 将肾组织于2.5%戊二醛中固定，1%锇酸固定，经脱水、包埋及染色处理后，使用透射电子显微镜4 000 倍下观察肾组织形态学变化。

1.2.6 血清BUN、Scr 和UA 水平检测 分别于给药前、末次给药24 h 后取血，采用全自动大型生化分析仪检测血清肾功能指标BUN、Scr 和UA 水平。

1.2.7 血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平检测取末次给药24 h 后的股主动脉血，4 ℃、4 000 r／min 离心，取血清，按照ELISA 试剂盒说明书检测TNF-α、AGEs、VCAM-1、MCP-1 水平。

1.2.8 肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平检测 精密称取0.5 g 大鼠肾组织，加0.5 mL 预冷生理盐水，匀浆，4 ℃、3 000 r／min 离心15 min 后吸取上清液。按照ELISA 试剂盒说明书检测各组大鼠肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平。

1.2.9 肾组织RAGE 表达检测 随机抽取各组4 只大鼠左侧肾脏，制成5 μm 的切片，孵育一抗、二抗后显色，苏木素轻度复染胞核，1%盐酸乙醇分化，梯度脱水，透明后中性树胶封片，200 倍镜下观察并采集图像，每张片随机取3个视野，利用Image-Pro Plus 6.0 软件进行分析。

1.2.10 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，若数据符合正态分布，以（±s） 表示，方差齐性采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，自身前后对照采用配对t检验；若数据方差不齐则采用Tamhane’s T2法检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学

2.1.1 疾病差异基因 筛选GSE30122 芯片，获得正常组和模型组差异基因638 个，其中DN 患者上调与下调基因分别为384、254 个，差异基因热图与火山图见图1。

图1 DN 差异基因热图（A） 和火山图（B）

图2 黄芪葛根汤作用靶点基因与DN 差异基因Venn 图

图3 中药复方调控网络

2.1.4 蛋白互作网络 将交集基因输入STRING 数据库，构建PPI 网络，通过R 语言筛选获得PPI 核心基因，见图4。

图4 PPI 蛋白互作网络（A） 和PPI 网络核心基因（B）

2.1.2 复方活性成分及靶点 获得黄芪活性成分20 个，葛根活性成分4 个，含1 个共有活性成分芒柄花素（formononetin），共23 个活性成分，对应靶点191 个。

2.1.3 中药复方调控网络 将黄芪葛根汤靶点基因与DN差异基因取交集，获得交集基因21 个，见图2。通过Cytoscape 绘制中药复方调控网络，包含43 条边（边代表黄芪葛根汤与DN 之间的相互作用），33 个结点（结点代表黄芪葛根汤活性成分和DN 靶点基因），见图3。

2.1.5 GO 功能与KEGG 通路富集分析 获得416 条GO 富集分析条目，包括BP 391 条，涉及蛋白激酶活性的正向调节、信号受体活性的正向调节等；CC 6 条，涉及分泌粒管腔、细胞质囊泡腔等；MF 19 条，涉及蛋白激酶调节剂活性、腺苷酸环化酶结合等，见图5。

图5 黄芪葛根汤GO 富集功能分析条形图

获得KEGG 通路30 条，包括AGE-RAGE 通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF-1 等信号通路，见图6。

图6 黄芪葛根汤KEGG 富集分析气泡图

2.2 动物实验

2.2.1 黄芪葛根汤对DN 大鼠空腹血糖值的影响 给药过程中，黄芪葛根汤高剂量组大鼠死亡2 只、盐酸二甲双胍组死亡1 只。最终正常组大鼠10 只，模型组、黄芪葛根汤高剂量组各10 只，黄芪葛根汤中、低剂量组各12 只，盐酸二甲双胍组10 只。如表1 所示，给药前与正常组比较，各造模组小鼠FBG 水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪葛根汤各剂量组和盐酸二甲双胍组FBG 水平均无明显变化（P＞0.05）。给药后与正常组比较，模型组FBG 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪葛根汤各剂量组和盐酸二甲双胍组FBG 水平均降低（P＜0.05），且黄芪葛根汤高组效果优于黄芪葛根汤低、中剂量组。

表1 各组大鼠血清FBG 水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清FBG 水平比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与黄芪葛根汤高剂量组比较，△P＜0.05。

组别动物数／只FBG／（mmol·L-1）治疗前治疗后正常组109.49±0.859.16±0.64模型组1021.72±2.40* 27.06±2.90*黄芪葛根汤高剂量组1021.17±2.93* 17.13±1.57＃黄芪葛根汤中剂量组1222.11±2.45* 18.06±1.61＃黄芪葛根汤低剂量组1222.30±2.73* 21.60±1.69＃△盐酸二甲双胍组1021.73±1.66*9.33±0.39＃△

2.2.2 黄芪葛根汤对DN 大鼠肾脏组织形态学的影响 如图7 所示，与正常组比较，各造模组大鼠肾小球基底膜增厚，系膜基质增多，足细胞足突融合；与模型组比较，各给药组大鼠肾小球基底增厚和足细胞足突融合均得到缓解，黄芪葛根汤高剂量组效果尤为显著。

图7 各组大鼠肾脏组织形态学电镜观察（×4 000）

2.2.3 黄芪葛根汤对DN 大鼠血清BUN、Scr 和UA 水平的影响 因给药前模型组与黄芪葛根汤各剂量组BUN、Scr 和UA 水平有差异，故对治疗前、后的变化量进行分析（变化量＝治疗前-治疗后）。如表2 所示，给药后与正常组比较，模型组BUN 水平变化量升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪葛根汤各剂量组BUN 和UA 水平均降低（P＜0.05），且黄芪葛根汤高剂量组降低血清BUN、Scr 和UA 水平效果最佳。

表2 各组大鼠BUN 、Scr、UA 水平变化量比较（±s）

表2 各组大鼠BUN 、Scr、UA 水平变化量比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与黄芪葛根汤高剂量组比较，△P＜0.05。

组别动物数／只BUN／（mmol·L-1）Scr／（μmol·L-1）UA／（μmol·L-1）正常组100.23±0.560.51±5.340.60±1.23模型组10-3.23±1.67*-5.86±11.54-2.60±2.78黄芪葛根汤高剂量组105.40±2.74＃1.45±17.0342.53±5.84＃黄芪葛根汤中剂量组122.92±2.86＃-1.83±15.3919.22±5.57＃△黄芪葛根汤低剂量组122.75±2.14＃-4.82±11.006.65±2.33＃△盐酸二甲双胍组10-6.10±5.21△-16.43±18.56-6.16±4.06△

2.2.4 黄芪葛根汤对DN 大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平的影响 如表3、图8 所示，与正常组比较，模型组AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平均升高 （P＜0.05）；与模型组比较，黄芪葛根汤各剂量组AGEs、TNFα、VCAM-1、MCP-1 水平均降低（P＜0.05），且黄芪葛根汤高剂量组降低大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1水平作用最佳。

表3 各组大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1 水平比较（pg／mL，±s）

表3 各组大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1 水平比较（pg／mL，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与黄芪葛根汤高剂量组比较，△P＜0.05。

组别动物数／只AGEsTNF-αVCAM-1正常组1040.966±5.88671.990±6.74241.379±2.895模型组10126.019±7.036*96.039±8.162*72.386±3.914*黄芪葛根汤高剂量组1061.385±6.188＃77.465±3.682＃52.833±2.440＃黄芪葛根汤中剂量组1279.785±5.945＃△81.232±6.102＃57.493±4.080＃△黄芪葛根汤低剂量组1298.429±8.284＃△84.580±4.405＃△66.322±5.621＃△盐酸二甲双胍组1047.618±6.152＃△83.804±2.875＃△47.508±3.473＃△

图8 各组大鼠血清MCP-1 水平（±s）

2.2.5 黄芪葛根汤对DN 大鼠肾组织VCAM-1、NF-κB p65水平的影响 如表4 所示，与正常组比较，模型组肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪葛根汤高、中剂量组肾组织VCAM-1 水平升高（P＜0.05），黄芪葛根汤各剂量组和盐酸二甲双胍组NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05），且黄芪葛根汤高剂量组降低肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平作用最优。

表4 各组大鼠肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平比较（ng／g，±s）

表4 各组大鼠肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平比较（ng／g，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与黄芪葛根汤高剂量组比较，△P＜0.05。

组别动物数／只VCAM-1NF-κB p65正常组10182.789±11.024127.699±8.149模型组10266.652±9.207*337.820±15.523*黄芪葛根汤高剂量组10203.524±22.960＃190.964±17.259＃黄芪葛根汤中剂量组12208.494±18.869＃208.832±18.849＃△黄芪葛根汤低剂量组12245.746±13.796295.529±14.691＃△盐酸二甲双胍组10247.857±9.134152.591±9.969＃△

2.2.6 黄芪葛根汤对DN 大鼠肾组织RAGE 表达的影响RAGE 蛋白阳性表达呈棕色或棕黄色。如图9 所示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织RAGE 蛋白阳性着色覆盖面积增多，蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪葛根汤各剂量组和盐酸二甲双胍组肾组织RAGE 蛋白阳性着色覆盖面积减少，表达降低（P＜0.05），且黄芪葛根汤高级剂量组降低RAGE 蛋白表达的作用最佳。

图9 各组大鼠肾组织RAGE 表达（×200，±s）

3 讨论

近年来，DN 发病率持续攀升，给社会带来沉重负担［15］。中医认为，消渴导致的肾损伤，是日久耗气伤血，瘀血内阻所致，故主要治法是益气养阴［16］。临床使用黄芪葛汤治疗糖尿病作用明显，但具体作用机制尚不明确［8，17］。DN 患者FBG 水平可反应DN 的严重程度，FBG 水平低的DN 患者发展为ERSD 的风险较低［18］。DN 可导致蛋白尿和肾小球弥漫性硬化，进而发展为终末期肾衰竭［19］。本研究发现，经黄芪葛根汤给药后，大鼠FBG 水平降低，透射电镜观察可见大鼠肾小球基底增厚和足细胞足突融合减轻，系膜基质减少，表明黄芪葛根汤可降低FBG，改善肾损伤。BUN、Scr 和UA 是评估肾脏功能的金指标［20-21］。肾小球发生损伤后，血清BUN、Scr 和UA 水平的升高多用于评估疾病严重程度［22］。本研究发现黄芪葛根汤可降低大鼠血清BUN、Scr 和UA 水平，改善肾功能。

本研究基于网络药理学预测黄芪葛根汤可能通过调节AGE-RAGE 通路及NF-κB 的表达治疗DN。DN 高血糖环境可导致糖基化终末产物积累，氧化损伤肾细胞，使DN 恶化［23］。研究表明，降低TNF-α 表达可抑制氧化应激反应进而改善DN 症状［24］。高血糖会使机体呈高凝状态，AGEs 结构稳定，会大量累积，并与其受体RAGE 结合后激活AGERAGE 通路激发NF-κB 核转录因子，引起诸多异常反应，如血管通透性增加、促炎因子释放等，造成肾组织的损伤［25-26］。NF-κB 会提高RAGE 的表达形成恶性循环，加剧肾损伤。VCAM-1 为免疫球蛋白超家族成员，DN 患者尿中VCAM-1 水平升高［27］。AGE-RAGE 通路可以使系膜细胞MCP-1 水平上调，引起单核与巨噬细胞浸润和迁移，加速肾间质纤维化及肾小球硬化［28-29］。DN 的炎症反应会激活IκB 激酶，释放NF-κB p65，促进炎症反应［30］。本研究结果显示，黄芪葛根汤可降低DN 大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平及肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平与RAGE 表达，缓解炎症反应、纤维化等生物过程，发挥对DN 的治疗作用，验证了网络药理学的分析结果。

本研究在网络药理学预测黄芪葛根汤活性成分、靶标及作用通路的基础上，通过动物实验验证黄芪葛根汤可能通过调节AGE-RAGE 信号通路，降低血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平与肾组织VCAM-1、NF-κB p65 水平及RAGE 表达缓解炎症反应及纤维化，减轻DN 大鼠肾脏损伤，发挥治疗作用。但本实验仍有局限性，第一，TCMSP等数据库筛选的成分受限于中药成分的理化性质，与煎煮后的成分并不等同，需通过HPLC 等进行检测；第二，本研究尚未探讨具体的药物成分和药物靶点的作用机制，需通过分子对接预测药物小分子和药物靶点的结合模式，并检测亲和力；第三，需结合细胞实验，进一步分析作用机制；第四，后期仍需采用多种检测手段，多角度验证。