小柴胡汤含药血清体外抗流感病毒的实验研究

霍雨佳，陈佳亮，邹文玮，郝莉鹏，2，张 磊，杨沛霖，李凌威，周一心，2*，潘丽峰，2*

（1.上海市浦东新区疾病预防控制中心，上海 200136；2.复旦大学浦东预防医学研究院，上海 200136；3.上海中医药大学上海中医健康服务协同创新中心，上海 201203；4.上海市奉贤区四团镇社区卫生服务中心，上海 201412）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病［1-2］，全球每年大约有10 亿人感染，其中重症病例有300～500 万例，死亡29～65 万例［3］。A （H1N1） pdm09 和H3N2，Victoria 型（BV） 和Yamagata 型（BY） 是目前主要流行的流感病毒亚型［4-6］。由于奥司他韦等化学药物大量使用，其耐药性日益严重［7-9］，因此需研究其他药物对流感的有效性与安全性。经方是“医药之祖”，小柴胡汤出自张仲景的《伤寒论》［10-11］，其中的柴胡、甘草等成分已被证实对感冒发烧、咳嗽痰多等症状有效并用于临床治疗［12］，但小柴胡汤方剂对流感的抗病毒作用研究鲜有报道。本研究通过探索小柴胡汤含药血清对流感病毒A（H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 4 种亚型株的抑制作用，以期为该药的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞 狗肾细胞 （Madin-Darby canine kidney cells，MDCK） 由上海市疾病预防控制中心提供。

1.2 毒株 流感病毒A （H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 亚型株为本实验室保存，其序列与A／Hawaii／70／2019（H1N1） 、A／Kansas／14／2017 （H3N2）、B／Victoria／17／2022、B／Washington／28／2020 无明显差异。

1.3 动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级SD 大鼠，体质量（300±15） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京）2016-0006］，饲养于上海中医药大学实验动物中心的SPF级屏障内，实验过程经上海中医药大学伦理委员会批准（伦理号PZSHUTCM220822005）。

1.4 药物与试剂 小柴胡汤含药血清由上海中医药大学协同创新中心制备。磷酸奥司他韦胶囊（上海罗氏制药有限公司，批号SH0093），无菌稀释至7 500 μg／mL 备用。DMEM 培养基、胎牛血清、EDTA-胰酶、青霉素-链霉素、HEPES 缓冲液、HBSS （美国Gibco 公司，批号2428750、2547014P、2323487、2199830、2428706、2492851）；TPCK-胰酶（美国Sigma 公司，CAS 号9002-07-7）；MTT 细胞增殖检测试剂盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司，批号IA19FA0007］。

1.5 仪器 生物安全柜（型号BSC-1500ⅡA2-X，山东博科医疗器械有限公司）；倒置显微镜（型号CKX41，日本Olympus 公司）；全自动酶联免疫检测仪（型号ELX800，美国BioTek 公司）；CO2培养箱（型号CCL-240B-8，新加坡ESCO 公司）；细胞计数仪（型号IC1000，上海睿钰生物科技有限公司）；低温冰箱（型号HYC-360，海尔集团公司）；水浴恒温振荡器（型号HSHZ-B，上海跃进医疗器械有限公司）；十功能自动煎药机、液体浓缩机（型号NS01、NS01，北京东华原医疗设备有限责任公司）。

2 方法

2.1 细胞生长液和病毒生长液的配制 500 mL DMEM 中加入青霉素-链霉素5 mL （终浓度为青霉素100 U／mL 和链霉素100 μg／mL） 和12.5 mL HEPES 缓冲液（终浓度为25 mmol／L）。将50 mL 胎牛血清加到450 mL 上述混合DMEM 中，使胎牛血清终浓度为10%，即得细胞生长液；向上述混合DMEM 中每500 mL 加入0.5 mL TPCK-胰酶（母液浓度为2 mg／mL，终浓度为2 μg／mL），即得病毒生长液。

2.2 小柴胡汤的制备 按照《伤寒论》 中小柴胡汤的原方比例，柴胡半斤（24 g）、黄芩三两（9 g）、人参三两（9 g）、甘草三两（9 g）、姜半夏半升（9 g）、生姜三两（9 g）、大枣四枚（9 g） （药材经上海中医药大学吴靳荣教授鉴定为正品） 配制。第1 次加8 倍量水煎煮，其中煎煮前先加入7 倍量水浸泡30 min，选择常压煎煮模式，武火煮沸后转为文火煎煮30 min；第2 次煎煮时，机器自动补充进20%加水量，武火煮沸后转为文火煎煮20 min，合并2 次煎煮的药液，投入液体浓缩机，浓缩至所需浓度备用。

2.3 小柴胡汤含药血清的制备 10 只大鼠随机分为中药组和对照组。小柴胡汤灌胃剂量依据人与大鼠体表面积换算得到为7.02 g／kg，对照组给予生理盐水，每天早晚各灌胃1 次，连续5 d。末次给药后1 h，大鼠腹腔注射水合氯醛（350 mg／kg） 麻醉，腹主动脉取血，室温静置0.5 h。4 ℃、3 000 r／min 离心10 min，取血清，同组大鼠血清合并混匀，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm 微孔滤膜无菌过滤，收集滤液，无菌封装，于-80 ℃冰箱保存备用。小柴胡汤含药血清经测定原始质量浓度为6 521.58 μg／mL。

2.4 MTT 法检测细胞活力 按照试剂盒使用说明书，在待测细胞孔中每孔加入10 μL MTT 试剂（终质量浓度为0.5 mg／mL），轻轻混合后在34 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，吸弃培养基，每孔加入100 μL Formazan 增溶溶液，将孔板置于摇床上轻轻摇晃10 min 以溶解甲臜结晶，使用酶标仪测定490 nm 波长处的吸光度值。

2.5 CPE 法观察细胞生长状态 将药物或病毒接种于生长状态良好的单层MDCK，于36 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天观察细胞生长状态，以药物或病毒的最高稀释度不再出现新病变为终点，记录病变情况与孔数（CPE＞50%为病变，CPE＜50%为非病变），见图1。

图1 MDCK 不同形态观察（×200）

2.6 半数中毒浓度（TC50） 测定 将生长状态良好、长成单层的MDCK 用EDTA-胰酶消化成单个细胞，用细胞生长液调整细胞密度为8×105／mL，接种至96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，于36 ℃、5% CO2培养箱中培养20 h，形成单层细胞备用。小柴胡汤含药血清从6 521.58 μg／mL 倍比稀释至50.95 μg／mL 共8 个质量浓度，每个稀释度均重复4孔，于34 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。按照“2.4” 项下MTT 法测定各孔吸光度值，并计算TC50及细胞存活率。

2.7 半数有效浓度（EC50） 测定 将流感病毒A （H1N1）pdm09、H3N2、BV、BY 4 种亚型株连续10 倍递次稀释成1×10-1～1×10-6后，将各稀释度病毒接种于MDCK 中，每个稀释度设4 个复孔，于34 ℃、5% CO2培养箱中培养，设置正常细胞对照，48 h 后观察病变孔数，用Reed-Muench法计算流感病毒4 种亚型株的半数组织培养感染剂量（median tissue culture infective dose，TCID50）。在小柴胡汤含药血清对MDCK 的TC50范围内，加入50 μL 配制好的100 TCID50流感病毒4 种亚型病毒液，再加入不同质量浓度小柴胡汤含药维持液，每孔50 μL，于34 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，每一药物浓度均重复4 孔，设置正常细胞对照、病毒对照、空白血清对照、阳性药物对照。按照“2.4” 项下MTT 法测定各孔吸光度值，并计算EC50、病毒抑制率及治疗指数（therapeutic index，TI），公式为TI＝TC50／EC50。

2.8 统计学分析 通过SPSS 22.0 及Excel 软件进行处理，数据以（±s） 表示，细胞存活率与药物浓度之间的关系用Probit 回归进行分析，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小柴胡汤含药血清对MDCK 的TC50小柴胡汤含药血清质量浓度从6 521.58 μg／mL 稀释至50.95 μg／mL 等8 个质量浓度时，细胞存活率从15.95% 升高至95.27%，细胞存活率和药物质量浓度呈反比。未用小柴胡汤含药血清处理的正常细胞存活率为100%。用Probit 回归法统计分析，小柴胡汤含药血清对MDCK 的TC50为3 533.59 μg／mL，磷酸奥司他韦的TC50为1 226.62 μg／mL，见图2。

图2 小柴胡汤含药血清和磷酸奥司他韦对MDCK 的细胞毒性作用

3.2 小柴胡汤含药血清的EC50用Reed-Muench 法计算得流感病毒A （H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 4 种亚型株的TCID50分别为1×10-3.1、1×10-2.8、1×10-2.8、1×10-3.0。在小柴胡汤含药血清对MDCK 的TC50范围内，病毒抑制率与小柴胡汤含药血清质量浓度呈正相关 ［rA（H1N1）pdm09＝0.719，P＜0.001；rH3N2＝0.709，P＝0.001；rBV＝0.703，P＝0.001；rBY＝0.878，P＜0.001］。在小柴胡汤含药血清质量浓度为1 630.40 μg／mL 时，对流感病毒4 种亚型株的抑制率分别为79.46%、88.16%、54.28%、57.38%；当质量浓度低至50.95 μg／mL 时，抑制率分别为 22.22%、33.20%、12.83%、11.15%。小柴胡汤含药血清对流感病毒4 种亚型株的EC50分别为288.12、173.90、1 037.85、1 107.27 μg／mL，TI 分别为12.26、20.32、3.40、3.19。磷酸奥司他韦胶囊的EC50分别为316.54、155.77、111.28、197.74 μg／mL，TI 分别为3.88、7.87、11.02、6.20，见表1～3。

表1 小柴胡汤含药血清对流感病毒4 种亚型株的抑制作用（±s，n＝4）

表1 小柴胡汤含药血清对流感病毒4 种亚型株的抑制作用（±s，n＝4）

注：与50.95 μg／mL 小柴胡汤含药血清组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

小柴胡汤含药血清／（μg·mL-1）抑制率／%A（H1N1）pdm09H3N2BV BY 1 630.4079.46±0.15▲▲88.16±0.24▲▲54.28±0.12▲▲57.38±0.05▲▲815.2063.64±0.14▲▲75.10±0.18▲47.77±0.02▲▲44.26±0.06▲▲407.6056.23±0.16▲62.55±0.1239.03±0.17▲36.07±0.03▲▲203.8045.29±0.1350.77±0.1131.60±0.0826.89±0.09▲101.9033.22±0.0439.38±0.1223.54±0.0718.03±0.05 50.9522.22±0.1633.20±0.1812.83±0.1211.15±0.05

表2 磷酸奥司他韦对流感病毒4 种亚型株的抑制作用（±s，n＝4）

表2 磷酸奥司他韦对流感病毒4 种亚型株的抑制作用（±s，n＝4）

磷酸奥司他韦／（μg·mL-1）抑制率／%A（H1N1）pdm09H3N2BVBY 937.502.29±0.0016.40±0.0816.56±0.237.08±0.00 468.7545.14±0.0052.71±0.0174.49±0.3158.86±0.00 234.3852.57±0.0554.65±0.0266.23±0.0454.77±0.00 117.1945.43±0.0548.53±0.0651.72±0.2239.78±0.00 58.5941.14±0.0042.05±0.0540.77±0.1135.29±0.01

表3 小柴胡汤含药血清和磷酸奥司他韦对流感病毒4 种亚型株的抑制作用

4 讨论

我国中药自然资源丰富，在防治病毒性疾病尤其是流感方面已取得较大成就［13-15］。颜海燕等［16］研究发现热毒宁注射液对流感病毒多个亚型有抑制作用；徐国双等［17］研究表明小槐花提取物能有效阻抑流感病毒；赵利华等［18］研究发现清开灵注射液在体外有拮抗流感病毒H1N1、H5N1、H7N9 3 种亚型的作用。

小柴胡汤由柴胡、黄芩、半夏、人参、生姜、甘草、大枣7 味药材组成，是和解少阳的代表方剂［19-20］。黄芩、甘草等单味中药和连花清瘟胶囊、双黄连制剂等复方药物已应用于临床［21］。为了确定小柴胡汤含药血清的抗流感病毒作用，本研究使用流感病毒敏感细胞MDCK 进行体外细胞实验，观察小柴胡汤含药血清对流感病毒A （H1N1）pdm09、H3N2、BV、BY 4 种亚型株的抗病毒作用。研究发现小柴胡汤含药血清对4 种流感病毒亚型株均有抗病毒作用，表现为病毒抑制率随着药物质量浓度的增加而增加，呈正相关作用，但对4 种流感病毒亚型株的病毒抑制率不同，其中对甲型流感病毒株的病毒抑制率高于乙型流感病毒株，原因可能是小柴胡汤含药血清对2 种类型病毒的敏感性不同。小柴胡汤含药血清对MDCK 的TC50为3 533.59 μg／mL，磷酸奥司他韦的TC50为1 226.62 μg／mL，提示小柴胡汤含药血清的毒性小于磷酸奥司他韦。小柴胡汤含药血清对4 种流感病毒亚型株的EC50分别为288.12、173.90、1 037.85、1 107.27 μg／mL，表明小柴胡汤含药血清对甲型流感病毒株的抑制效果优于乙型流感病毒株。小柴胡汤含药血清对4 种流感病毒亚型株的TI 分别为12.26、20.32、3.40、3.19，而磷酸奥司他韦的TI 分别为3.88、7.87、11.02、6.20，结果表明小柴胡汤含药血清对甲型流感病毒的治疗指数和安全性均高于磷酸奥司他韦。

综上所述，小柴胡汤含药血清在体外能有效抑制流感病毒，具有抗流感病毒作用，但其有效成分与抗病毒作用的关系有待进一步研究。