芍药甘草汤通过调控PI3K／Akt／mTOR 通路对帕金森病大鼠多巴胺能神经元自噬的影响

赵贝贝，崔晓峰，金远林，黄汝成，刘晓铭

（深圳市宝安区中医院，广东 深圳 518133）

芍药甘草汤由芍药和甘草组成，源自张仲景《伤寒论》，“若厥愈足温者，更作芍药甘草汤与之，其脚即伸”。白芍苦酸，甘草甘平，酸甘合化，能养血敛阴，和中缓急，阴液得复，筋脉得养，共奏益阴柔筋缓急之功。现代研究表明，芍药甘草汤在神经系统疾病中应用广泛，如三叉神经痛［1］、癫痫［2］、脊髓损伤［3］、周围神经损伤［4］、帕金森病［5］等。帕金森病为神经退行性运动障碍疾病，主要症状是震颤、僵硬、运动迟缓、运动不稳、体位不稳等，具有逐渐加重的特征，严重影响患者的生活质量［6］。目前认为脑黑质多巴胺能神经元变性和丢失是帕金森病的主要病理学特征［7］。课题组前期研究发现，芍药甘草汤可有效保护大鼠帕金森病模型脑黑质内神经元，缓解肌强直，提高帕金森病大鼠自主活动度［8］，但其作用机制尚不清楚。新的研究表明，多巴胺能神经元自噬能力的降低是造成神经元变性和丢失的重要原因，调节自噬是防治帕金森病的重要途径之一［7，9］。基于此，本研究将探讨芍药甘草汤对帕金森病大鼠模型脑黑质多巴胺能神经元自噬水平的调控及作用机制。

1 材料

1.1 动物 38 只SPF 级Sprague-Dawley （SD） 雄性大鼠，体质量180～200 g，购自斯贝福（北京） 生物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2019-0010］，饲养于瑞业模型动物（广州） 生物科技有限公司SPF 级动物实验室［实验动物使用许可证号SYXK （粤） 2020-0218］。本实验设计经瑞业模型动物中心实验动物伦理委员会批准（伦理号20220312）。

1.2 药物与试剂 甘草片（批号210500521） 和白芍（批号211000209） 购自康美药业股份有限公司，经深圳市宝安区中医院主管中药师梁华钧鉴定为豆科植物甘草的干燥根茎和芍药科植物芍药的干燥根。羟基多巴胺 （6-OHDA）、阿扑吗啡（APO） （批号G2104010、G2205058，德国Merck 公司）；Beclin1 抗体、Lamp2 抗体、PI3K p85α抗体、Akt1 抗体、p-Akt1 抗体、mTOR 抗体、p-mTOR 抗体、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ抗体、LC3Ⅱ抗体、GAPDH 抗体（批号GR220243-2、GR270186-4、GR3245955-1、GR240003-94、GR3241584-3、GR133550-7、GR284919-8、GR3183128-17、GR3252679-1、GR217575-73，英国 Abcam 公司）；Goat anti-mouse IgG、Goat anti-rabbit IgG （批号bst17go4a17h50、bst18a12b18b54，武汉博士德生物工程有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号092221220421，上海碧云天生物技术有限公司）；DAB 显色试剂盒（批号2207035，北京中杉金桥生物技术有限公司）；ECL 化学发光液 （批号AB2109，德国ABP Biosciences 公司）。

1.3 仪器 脑立体定位仪、电动颅骨钻（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Tecnai G2 Spirit 透射电镜（捷克FEI 公司）；酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 芍药甘草汤的制备 称取白芍、甘草各62.5 g，加水1 500 mL 浸泡60 min，煎煮30 min 后过滤，再次加水600 mL，第2 次煎煮20 min 后过滤，合并2 次滤液，浓缩至300 mL，备用。

2.2 造模、分组及给药 随机选取20 只大鼠采用左侧纹状体两点注射6-羟基多巴胺（6-OHDA） 制备帕金森病模型［8］；假手术组注射等量生理盐水；另设正常组不做任何处理，造模后第4 周，采用APO 诱发旋转实验评价模型是否成功。将造模成功的帕金森病大鼠随机分为模型组和芍药甘草汤组（12 g／kg），每组9 只，连续灌胃给药28 d。

2.3 大鼠旋转行为学检测 给药结束后，采用APO 诱发旋转行为学，即在各组大鼠的颈背部皮下注射APO（0.5 mg／kg） 诱发其出现旋转行为，记录开始旋转后30 min内旋转圈数，计算其旋转速度。

2.4 透射电镜观察大鼠脑黑质区多巴胺能神经元的自噬小体 大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠进行麻醉，取脑黑质区组织，立即置于2.5%戊二醛中固定4 h 以上，并于4 ℃保存。将前固定的脑组织用PBS 缓冲液清洗3 次，使用1%四氧化锇固定2 h，于4 ℃冰箱保存，PBS 缓冲液清洗3 次后，50%、70%、80%和90% 乙醇梯度脱水10 min，置于100%乙醇和丙酮中各脱水2 次，将脱水后的组织置于丙酮和包埋液比例为3 ∶1 的溶液中孵育0.5 h，然后置于丙酮和包埋液比例为1 ∶1 的溶液中孵育4 h，最后置于纯包埋液中4 ℃孵育过夜，次日用包埋剂包埋样品，置于烤箱内进行聚合，条件为37 ℃，24 h；60 ℃，48 h。用Leica UC7超薄切片机将以上处理的脑组织样品切成厚度约100 nm的超薄切片，进行醋酸双氧铀染色20 min 和柠檬酸铅染色12 min，最后于透射电镜下观察并拍照。

2.5 Western blot 法检测大鼠脑黑质区自噬相关蛋白表达 取大鼠脑黑质区，提取总蛋白并按照BCA 法检测总蛋白的浓度，蛋白溶液加入上样buffer 后，于水浴锅中煮沸5 min进行变性。随后进行SDS-PAGE 电泳，使用半干转膜法将凝胶上的蛋白转移到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭液在室温下封闭1 h，TBST 洗膜，于稀释后的Beclin1、Lamp2、PI3K p85α、Akt1、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ、GAPDH 一抗溶液中4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜，使用稀释后的对应二抗在37 ℃下孵育1 h，TBST 洗膜后，按照ECL 发光液的操作说明进行显色、曝光，通过Image-Pro Plus 软件分析条带的灰度值，计算目标蛋白的相对表达量。

2.6 免疫组化法观察大鼠脑黑质区自噬相关蛋白表达 深度麻醉大鼠后，进行生理盐水（约100 mL） 和4 ℃、4%多聚甲醛（约200 mL） 灌注，随后取出大脑的黑质区并置于4%多聚甲醛固定，按照常规方法进行组织包埋和切片。将切片放置于60 ℃恒温箱中烘烤过夜，次日脱蜡至水，使用0.01 mol／L 枸橼酸钠缓冲溶液进行抗原修复，3% H2O2室温封闭15 min，PBS 洗涤，5% BSA 封闭液孵育15 min，滴加稀释后的Beclin1、LC3-Ⅱ、p-Akt、p-mTOR 一抗，4 ℃孵育过夜，次日PBS 洗涤，随后滴加聚合HRP 标记二抗，室温孵育1 h，PBS 洗涤，DAB 显色液染色5～10 min，于显微镜下观察显色情况，并水洗终止显色。按照常规方法进行苏木素复染、1%盐酸分化及流水返蓝，然后将切片放入梯度乙醇中进行脱水，二甲苯浸泡10 min，最后使用中性树胶封片，于光镜下观察并拍照。每张组织切片随机选取5 个视野，使用Image J 软件测量阳性染色比例，并进行归一化分析。

2.7 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 芍药甘草汤对帕金森病大鼠旋转行为的影响 给药结束之后进行APO 诱发旋转行为学检测，结果表明，正常组和假手术组大鼠均未出现有效的旋转行为。模型组和芍药甘草汤组大鼠的有效旋转圈数分别为292±19、128±20，转速分别为9.7、4.3 r／min，差异具有统计学意义 （P＜0.01）。表明芍药甘草汤能有效改善帕金森病大鼠的症状。

3.2 芍药甘草汤对帕金森病大鼠脑黑质区多巴胺能神经元自噬小体形成的影响 如图1 所示，与正常组比较，假手术组黑质区多巴胺能神经元内自噬小体数量未见明显改变；与假手术组比较，模型组黑质区多巴胺能神经元内自噬小体数量减少；与模型组比较，芍药甘草汤组黑质区多巴胺能神经元内自噬小体数量增多，表明芍药甘草汤处理可以有效增加帕金森病大鼠黑质区多巴胺能神经元自噬小体的形成。

图1 各组大鼠脑黑质区多巴胺能神经元内自噬小体形成情况

3.3 芍药甘草汤对帕金森病大鼠脑黑质区自噬调控蛋白表达的影响 Western blot 结果如图2、表1 所示，与正常组比较，假手术组Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表达无明显变化（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，芍药甘草汤组Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表达升高（P＜0.01）。

表1 各组大鼠脑黑质区Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白相对表达比较（±s，n＝3）

表1 各组大鼠脑黑质区Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白相对表达比较（±s，n＝3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别Beclin1／GAPDHLamp2／GAPDH LC3Ⅱ／LC3Ⅰ正常组0.32±0.030.38±0.041.80±0.13假手术组0.31±0.050.35±0.061.71±0.16模型组0.08±0.02**0.19±0.02**0.37±0.02**芍药甘草汤组0.14±0.03＃＃0.33±0.05＃＃1.46±0.05＃＃

图2 各组大鼠脑黑质区Beclin1、Lamp2、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白条带图

免疫组化结果如图3 所示，正常组、假手术组、模型组和芍药甘草汤组Beclin1 蛋白阳性表达细胞比值分别为1.00±0.10、1.03±0.09、0.45±0.11、0.87±0.12，LC3Ⅱ蛋白阳性表达细胞比值分别为1.00±0.12、0.96±0.11、0.66±0.10、0.93±0.09。模型组Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表达较假手术组降低（P＜0.01）；芍药甘草汤组Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表达较模型组升高（P＜0.01）。免疫组化和Western blot 检测Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白在各组的变化趋势一致，表明芍药甘草汤处理可以有效提高帕金森病大鼠黑质区自噬调控蛋白的表达。

图3 各组大鼠脑黑质区Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白阳性表达情况

3.4 芍药甘草汤对帕金森病大鼠脑黑质区PI3K／Akt／mTOR 通路的影响 Western blot 结果如图4、表2 所示，各组大鼠脑黒质区Akt1 和mTOR 蛋白表达比较无明显差异（P＞0.05）。与正常组比较，假手术组PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和p-mTOR／mTOR 蛋白表达无明显变化（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和pmTOR／mTOR 蛋白表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，芍药甘草汤组PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和p-mTOR／mTOR蛋白表达降低（P＜0.01）。

表2 各组大鼠脑黑质区PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和pmTOR／mTOR 蛋白相对表达比较（±s，n＝3）

表2 各组大鼠脑黑质区PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和pmTOR／mTOR 蛋白相对表达比较（±s，n＝3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别PI3K p85α／GAPDH p-Akt1／Akt1 p-mTOR／mTOR正常组0.40±0.080.38±0.020.25±0.03假手术组0.41±0.130.36±0.020.24±0.05模型组1.78±0.19**0.89±0.08** 1.26±0.11**芍药甘草汤组0.77±0.15＃＃0.53±0.03＃＃0.81±0.06＃＃

图4 各组大鼠脑黑质区PI3K p85α、Akt1、p-Akt1、mTOR 和p-mTOR 蛋白条带图

免疫组化结果如图5 所示，正常组、假手术组、模型组和芍药甘草汤组p-Akt1 蛋白阳性表达细胞比值分别为1.00±0.12、0.98±0.10、1.85±0.13、1.17±0.14，p-mTOR蛋白阳性表达细胞比值分别为1.00±0.14、1.06±0.13、2.06±0.14、1.35±0.15。模型组p-Akt1 和p-mTOR 蛋白表达较假手术组升高（P＜0.01）；芍药甘草汤组p-Akt1 和pmTOR 蛋白表达较模型组降低 （P＜0.01）。免疫组化和Western blot 检测p-Akt1 和p-mTOR 蛋白在各组的变化趋势一致，表明芍药甘草汤处理可以有效抑制帕金森病大鼠黑质区PI3K／Akt／mTOR 通路的激活。

图5 各组大鼠脑黑质区p-Akt1 和p-mTOR 蛋白阳性表达情况

4 讨论

芍药甘草汤为酸甘化阴之剂，甘草以生阳明之津，芍药以和太阴之液，其脚即伸，与治疗帕金森病的“脚挛急” “肌强直” 临床症状有相似之处，为治疗帕金森病肌强直提供了中医临床基础。临床研究发现经方芍药甘草汤治疗帕金森病的肌强直症状疗效显著［5，10］。课题组前期研究发现，芍药甘草汤可有效改善帕金森病大鼠脑内神经递质水平，提高黑质区酪氨酸羟化酶，缓解肌强直，提高大鼠自主活动度［8］。多巴胺能神经元自噬能力的降低是导致其变性丢失的重要因素之一［11］。自噬是一种去除细胞内异常蛋白质和受损细胞器等物质以维持细胞生存和内稳态的细胞机制［12］。细胞自噬水平的改变是帕金森病发病的关键因素，研究显示增强自噬对帕金森病有潜在的治疗作用［13-14］。本研究在以往研究的基础上探讨芍药甘草汤通过调节自噬保护多巴胺能神经元的作用机制，以期为芍药甘草汤的临床应用提供新的理论基础。

通过6-OHDA 诱导帕金森病模型是研究帕金森病的最常用动物模型之一［15］。APO 诱发旋转实验结果表明芍药甘草汤可改善帕金森病大鼠症状。本研究发现模型组大鼠脑黑质区细胞内自噬小体数量减少，自噬调控蛋白Beclin1、Lamp2 表达及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值降低。Beclin1 在自噬过程中发挥核心作用，其表达与自噬程度呈正相关［16］。LC3 参与自噬的形成，自噬形成时，胞浆型LC3 （即LC3Ⅰ） 会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体） 膜型（即LC3Ⅱ），LC3Ⅱ升高代表自噬的启动［17］。Lamp2 是自溶酶体成熟的中介，其表达与自噬程度亦呈正相关［18］。研究显示6-OHDA 诱导可抑制大鼠脑黑质区细胞的自噬能力［19］。芍药甘草汤组大鼠脑黑质区则出现了自噬小体数量增多，自噬调控蛋白Beclin1、Lamp2 表达及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值降低的现象，这些结果提示芍药甘草汤可抑制6-OHDA 对大鼠脑黑质的影响，促进黑质多巴胺能神经元的自噬，进而改善帕金森病大鼠的症状。

PI3K／Akt／mTOR 通路是调控自噬的关键信号通路，当该通路被激活时，表现为细胞自噬能力降低［20］。研究表明抑制PI3K／Akt／mTOR 通路可以起到神经保护的作用［21］。本研究发现帕金森病大鼠脑黑质PI3K／Akt／mTOR 通路被激活，而芍药甘草汤处理则可以有效抑制PI3K／Akt／mTOR 通路的活化，表明芍药甘草汤可能通过抑制PI3K／Akt／mTOR通路增强黑质多巴胺能神经元的自噬能力进而改善帕金森病大鼠的症状。此外，芍药及甘草中的一些单体也具有调控PI3K／Akt／mTOR 通路的作用［22-23］，这些研究丰富了芍药甘草汤抑制PI3K／Akt／mTOR 通路促进自噬的理论依据。

综上所述，芍药甘草汤能增强6-OHDA 诱导的帕金森病大鼠脑黑质多巴胺能神经元的自噬能力，其可能的机制与抑制PI3K／Akt／mTOR 通路有关。芍药甘草汤具有多组分、多靶点、多效应的特点［24］，抑制PI3K／Akt／mTOR 通路促进自噬可能是芍药甘草汤发挥作用的靶点之一。