芦根亲水共有成分及解酒护肝的“谱-效-味” 关系研究

陈光宇，瞿昊宇，谢梦洲，孙 晶，范 蓓，王凤忠

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工质量安全风险评估实验室，农业农村部农产品质量安全收贮运管控重点实验室，北京 100193；2.湖南中医药大学，湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南中医药大学中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208）

目前对芦根、芦根提取物及单体的研究主要集中于水煎液［1-2］、多糖［3-4］、水提干浸膏粉［5-6］、大孔树脂提取物［7］、硅胶柱色谱纯化的非极性单体［8］，而关于强极性的亲水性单体报道则相对较少。这是因为目前的色谱分离体系中，应用较多的分析填料主要是适合分离醇溶性化合物的十八烷基硅烷键合硅胶，应用较多的分离填料主要是适合分离脂溶性化合物的硅胶、氧化铝等。然而，对于芦根及提取物，特别是鲜芦根，其经典用药形式为水煎汤剂［9］，其活性多糖分子量、低聚糖及单糖组成、结构尚不清楚，对于建立活性单体定量指标缺乏依据。故寻找强极性活性成分，对于芦根质量标准的改进、药食同源产品、复方制剂开发具有重要意义。

近年来，亲水色谱串联质谱［10-11］、分子排阻色谱［12-13］等新型方法对于药食同源、鲜药、中药中强极性成分具有更好的保留作用，可以很好地对植物氨基酸、多糖、苷类、肽类等成分进行表征。本研究根据特有性、有效性、传递与溯源、可测性、配伍环境等五原则［14］，对强极性亲水性化学成分改进分析方法，扩展分析范围，建立“谱-效-味” 相关数据库具有重要意义，以期为药食同源、鲜药、中药成分分析提供新思路。

1 材料

1.1 仪器 Exion LC AD 型超高效液相色谱仪、X-500R 型飞行时间四极杆质谱仪（美国AB Sciex公司）；Ultimate 型液相色谱仪，配紫外、示差折光检测器（美国Thermo 公司）；SA402B 型电子舌（日本Insent 公司）；DM 1000 型显微镜 （德国Leica 公司）；iMaik 型酶标仪 （美国 Bio-Rad公司）。

1.2 试剂 葡聚糖T100 （批号H29M11B114192）、葡聚糖T50 （批号H23S11B125400）、葡聚糖T20（批号 M01GS142715）、葡聚糖 T10 （批号A19GS145781）、葡聚糖T5 （批号N08GS166773）、葡聚糖T2 （批号H21S8B44410）、葡聚糖T1 （批号A14GS157734） 对照品，纯度＞98%，均购自上海源叶生物科技有限公司。ALT、AST、LDH、TG、VLDL ELISA 试剂盒均购自江苏晶美生物科技有限公司。乙腈（批号18100306LM01）、甲醇（批号17111204LM01） 均为色谱纯，购自瑞典Oceanpak公司；无水乙醇购自上海沃凯生物技术有限公司；水为超纯水。

1.2 动物 SPF 级湖南大鼠98 只，体质量（240±10） g，4～6 周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK （湘）2020-0002。所有大鼠均饲养于湖南中医药大学动物房，饲养环境为室温（25±1）℃，自由饮食，适应性饲养7 d，观察其一般状况。本研究获得湖南中医 药 大 学 动 物 伦 理 委 员 会 批 准（LL2021061602）。

1.3 药物 芦根鲜品均由湖南省音爽生物科技有限公司提供，经由湖南中医药大学王智副教授鉴定为禾本科植物芦苇PhragmitescommunisTrin.的新鲜根茎，样品信息详见表1。

表1 样品信息Tab．1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 芦根鲜品、饮片及水煎滤液、芦根水提冻干粉及水提液的制备与收率

2.1.1 芦根鲜品水煎滤液制备 称取芦根鲜品（S3） 185 g，用水煎煮2 次，每次1 h，合并滤液，加水将滤液定容至1 000 mL，即得。

2.1.2 芦根饮片水煎滤液制备 取芦根鲜品（S1～S12），除去杂质，洗净，切段，45 ℃鼓风干燥6 h，即得芦根饮片。称取50 g，用水煎煮2 次，每次1 h，合并滤液，加纯化水将滤液定容至1 000 mL，即得。

2.1.3 芦根水提冻干粉及水提液制备 取芦根饮片（S3） 50 g，用水煎煮2 次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得芦根水提冻干粉。称取冻干粉10 g，加水定容至1 000 mL，超声处理（功率200 W，频率50 kHz） 60 min，放冷，即得。

2.1.4 芦根鲜品-饮片-水提冻干粉的收率 芦根由鲜品制备成饮片收率为27.14%，由鲜品制备成水提冻干粉收率为5.44%，由饮片制备成水提冻干粉收率为20.05%，即185 g 芦根鲜品可得50 g芦根饮片，可得10 g 芦根水提冻干粉。

2.2 反相／亲水色谱串联四极杆-飞行时间质谱法分析芦根共有成分

2.2.1 反相色谱空白对照溶液制备 取超纯水，12 000 r／min 离心10 min，即得。

2.2.2 亲水色谱空白对照溶液制备 取80% 乙腈，12 000 r／min 离心10 min，即得。

2.2.3 反相色谱供试品溶液制备 取“2.1” 项下芦根鲜品水煎滤液、芦根饮片水煎滤液、芦根水提冻干粉水提液，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，即得芦根鲜品供试品溶液、芦根饮片供试品溶液，芦根水提冻干粉供试品溶液。

2.2.4 亲水色谱供试品溶液制备 取“2.2.3”项下供试品溶液各1 mL，置于10 mL 离心管中，加80% 乙腈定容至10 mL，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，即得。

2.2.5 反相色谱条件 WATERS ACQUITY UPLC＠BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脱（0～10 min，10% A；10～45 min，10%～90% A；45～49 min，90%A；49～50 min，90%～10%A；50～60 min，10%A）；体积流量0.3 mL／min；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.2.6 亲水色谱条件 WATERS ACQUITY UPLC＠BEH Amid 色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相乙腈 （A）-水 （B），梯度洗脱 （0～10 min，100%A；10～20 min，100%～70%A；20～30 min，70%A；30～32.5 min，70%～100%A；32.5～45 min，100% A）；体积流量0.3 mL／min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.2.7 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式；质量扫描范围m／z100～1 000；喷雾电压5 500、-4 500 V；雾化气温度550 ℃；气帘气35 psi （1 psi＝6.895 kPa）；辅助气、雾化气50 psi；碰撞能量（35±15） eV。TOF／MS 一级预扫描、TOF／MS／MS 二级扫描离子累积时间分别为100、1 150 ms，触发二级扫描的方法为信息依赖扫描（IDA），条件为多重质量亏损（MMDF）、动态背景扣除（DBS），满足者优先进行。

各供试品溶液总离子流图（反相负离子） 见图1。

图1 芦根的UPLC-Q-TOF-MS／MS 总离子流图Fig．1 Total ion flow diagram of UPLC-Q-TOF-MS／MS for Phragmitis Rhizoma

2.2.8 结果 共得到290 种成分，通过Cytoscape 3.7.1 软件找出25 种共有成分，再与芦根鲜品、芦根水提冻干粉比较筛选出12 种共有成分，见图2，各共有成分峰面积（n＝3） 情况见图3。

图2 芦根的UPLC-Q-TOF-MS／MS 共有成分分析Fig．2 Common compounds in UPLC-Q-TOF-MS／MS analysis of Phragmitis Rhizoma

图3 芦根的UPLC-Q-TOF-MS／MS 共有成分峰面积（n＝3）Fig．3 Peak areas of common compounds in UPLC-Q-TOF-MS／MS analysis of Phragmitis Rhizoma （n＝3）

由图3 可知，对香豆酸、对羟基苯甲醛、L-天冬氨酸、异阿魏酸含量较高。芦根鲜品制备成芦根饮片后，金线莲苷、次黄嘌呤、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、谷氨酸、芹菜素、阿魏酸、leucosceptoside A、洋川芎内酯A、秦皮素、马钱子碱、异鼠李素、L-焦谷氨酸、L-色氨酸、苯丙氨酸、L-络氨酸、D-苏氨酸、L-丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸这20 种成分含量减少；芦根饮片制备成芦根水提冻干粉后，咖啡酸、维生素B2、（-）-松脂素、D-哌啶酸、山梨糖醇、脯氨酸、腺嘌呤、鸟嘌呤这8 种成分含量减少，高香草酸、2-吲哚甲酸、肉桂酸、异夏佛塔苷、尼泊金甲酯、京尼平苷、4-羟基香豆素、红车轴草素-7-O-D-葡萄糖苷、橙皮苷、棕矢车菊素、芒柄花素、姜糖脂B这12 种成分含量增加。

2.3 网络药理-分子对接技术预测芦根共有成分活性 参考文献［15-16］报道，利用SwissTargetPrediction 数据库预测芦根共有成分作用于157 个靶点，选择其中度值排名前二十的作用靶点，通过KEGG 预测可以作用于57 条通路，其中可以从AKT1、NFKB1、TLR4 靶点调控酒精性肝疾病信号通路，见图4。再根据AKT1 （7nh4） 靶点蛋白计算芦根共有成分结合能大小，作为其活性评价依据，部分成分结合情况见图5，11 种成分结合能见表2。分子对接结果显示，腺苷环磷酸酯、鸟嘌呤核糖苷-3，5-环磷酸酯、刺五加苷E、西伯利亚远志糖A5 等4 种成分有相对较高活性。

图4 芦根共有成分在酒精性肝疾病信号通路中作用靶点Fig．4 Target effects of common compounds from Phragmitis Rhizoma in signalling pathway of alcoholic liver disease

图5 对香豆酸与AKT1 靶点蛋白结合情况Fig．5 Binding between p-coumaric acid and AKT1 target protein

表2 芦根共有成分与靶蛋白AKT1 的结合能Tab．2 Binding energy of target protein AKT1 with common compounds of Phragmitis Rhizoma

2.4 基于分子排阻色谱串联示差折光法分析芦根中糖类成分分子量

2.4.1 空白溶液制备 取超纯水，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4.2 对照品溶液制备 制备质量浓度为10.11、10.35、10.21、10.32、10.04、11.32、10.01 mg／mL的葡聚糖T100、葡聚糖T50、葡聚糖T20、葡聚糖T10、葡聚糖T5、葡聚糖T2、葡聚糖T1 （分子量分别为100、50、20、10、5、2、1 kDa） 的照品溶液。

2.4.3 供试品溶液制备 按“2.2.3” 项下方法制备，即得。

2.4.4 分子排阻色谱条件 Shodex SUGAR KS-804色谱柱（8.0 mm×300 mm，7 μm）；流动相水；体积流量0.5 mL／min；柱温50 ℃；进样量10 μL；示差折光检测，色谱图见图6。

图6 芦根分子排阻色谱图Fig．6 Molecular exclusion chromatogram of Phragmitis Rhizoma

2.4.7 分子排阻色谱结果分析 芦根多糖的分子量集中分布在1～2 kDa 及100～200 kDa 这2 个区间段，其中糖类共有成分分子量为1 600、1 000 Da （命名为芦根多糖1600、1000），芦根饮片经过水煎浓缩冷冻干燥为干浸膏粉过程中，芦根多糖1600 相对峰面积减少，而芦根多糖1000 相对峰面积小幅度增加，结果见图7。

图7 芦根分子排阻共有峰面积（n＝3）Fig．7 Common peak areas in molecular exclusion chromatogram of Phragmitis Rhizoma （n＝3）

2.5 电子舌分析芦根滋味

2.5.1 供试品溶液制备 取“2.2.3” 项下供试品溶液，即得。

2.5.2 电子舌分析条件 数据采集前，对电子舌进行传感器活化、校准等操作，确保检测数据的可靠性与稳定性。将50 mL 滤液置于电子舌专用容器中，样品采集与清洗交替进行。样品测定时间为90 s，采集周期1.0 s，采集延迟0 s，搅拌速率1 r／s，清洗（基准液） 时间336 s，截止时间20 s。

2.5.3 分析方法 检测环境温度为室温，每个样品除甜味测定5 次外，其余均测定4 次，选取后3次稳定的电子舌响应值取平均值进行分析。

2.5.4 电子舌雷达图 见图8。

图8 芦根的电子舌雷达图（n＝3）Fig．8 Electronic tongue radar map of Phragmitis Rhizoma （n＝3）

2.5.5 结果分析 芦根鲜品制备成芦根饮片后，酸味、苦味和苦味回味值增加，甜味值、涩味值、鲜味、咸味值减小。芦根饮片经过水煎浓缩冷冻干燥为冻干粉后，甜味值增加，涩味、鲜味值基本不变，酸味值小幅度减小，苦味和苦味回味值大幅度减小。

2.6 芦根饮片水煎滤液对急性酒精性肝损伤大鼠的影响 参照文献［7］ 报道，制备芦根饮片水煎浓缩汤剂，大鼠随机分为空白组、模型组、给药组（S1～S12），每组7 只，各组大鼠灌胃给予相应药物10 mL／kg，每天1 次，空白组、模型组灌胃给予等体积纯化水，连续灌胃14 d。模型组、给药组于第15 天一次性灌胃给予50%乙醇14 mL／kg，空白组给予等体积纯化水，禁食16 h。各组大鼠腹腔注射60 mg／kg 的戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉取血，并取肝组织。

2.6.1 大鼠肝组织病理学形态结果 将各组大鼠肝脏左叶保存在10%福尔马林溶液中固定，经过乙醇脱水、石蜡包埋后，每片肝组织制成5 μm 超薄切片，进行常规苏木精、伊红染色，在显微镜下连续观察整张组织切片中脂滴在肝脏的分布范围和面积，结果见图9。由此可知，空白组大鼠肝细胞较为清晰，肝细胞索整齐有序，颜色鲜艳，胞浆内未现脂滴，肝组织未现异常；与空白组比较，模型组大鼠肝细胞较为模糊，肝细胞索紊乱，肝细胞呈现多处脂滴，随有炎细胞浸润，表明一次性给予大量酒精对大鼠肝脏造成损伤；与模型组比较，各给药组大鼠肝细胞均可见有一定炎症细胞浸润，但S4～S5、S7～S9 组大鼠肝细胞脂滴减少，肝索排列较为整齐，结构趋于正常。

图9 各组大鼠肝组织病理学形态Fig．9 Pathological morphology of rat liver in each group

2.6.2 大鼠血清ALT、AST、LDH、TG、VLDL 水平 将大鼠血液于4 ℃、4 000 r／min 离心15 min，取上清液，严格按照相关试剂盒说明书操作，检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、甘油三酯（TG）、极低密度脂蛋白（VLDL） 水平，结果见图10。与空白组比较，模型组大鼠血清 ALT、AST、LDH、TG、VLDL 水平升高（P＜0.05），表明造模成功；与模型组比较，S4、S7～S9 组ALT 水平降低 （P＜0.05），S4～S5、S7～S8 组AST 水平降低 （P＜0.05），各给药组LDH 水平降低（P＜0.05），S4、S7、S9 组TG、VLDL 水平降低（P＜0.05）。

图10 各组大鼠血清ALT、AST、LDH、TG、VLDL 水平（±s，n＝6）Fig．10 The serum levels of ALT，AST，LDH，TG，VLDL in rats of each group （±s，n＝6）

2.7 芦根共有成分的“谱-效-味” 相关分析 以药效评价指标浓度为纵坐标（Y），UPLC-Q-TOFMS／MS 共有成分峰、分子排阻共有峰面积、电子舌味觉值为横坐标 （X），采用偏最小二乘法（PLS） 进行相关分析，采用皮尔逊法进行相关分析，结果见图11。根据最小二乘法及皮尔逊相关分析，ΔALT、ΔAST 与腺苷环磷酸酯、鸟嘌呤核糖苷-3，5-环磷酸酯相关性极显著，ΔLDH 与对香豆酸峰面积、酸味觉值相关性极显著，ΔTG、ΔVLDL与芦根多糖1600 峰面积、蔗糖含量相关性极显著，ΔAST、ΔVLDL 还与甜味觉值相关性极显著。

图11 最小二乘法及皮尔逊相关分析芦根共有成分的“谱-效-味” 结果Fig．11 Results of “spectrum-effect-taste” for common compounds of Phragmitis Rhizoma by PLS and pearson correlation analyses

3 讨论

本研究在探索芦根成分同时结合亲水色谱、分子排阻色谱、药效实验及电子舌味觉分析，拓展了传统中药“谱-效” 学范围，建立了药食同源类原料芦根“谱-效-味” 相关分析数据库，不仅可为芦根亲水性成分及质量标志物的寻找提供实验依据，也为药食同源、鲜药、中药中亲水性化学成分分析及质量标准控制提供了一条新思路。

芦根多糖1600、腺苷环磷酸酯、鸟嘌呤核糖苷-3，5-环磷酸酯、刺五加苷E［17-19］、西伯利亚远志糖A5［20-22］等可作为芦根活性成分，虽然蔗糖、葡萄糖、果糖、对香豆酸、L-天冬氨酸的特有性、有效性不强，但其在芦根中有相对较高含量，也是芦根重要组成成分。

对于芦根多糖类成分，分子量在10 kDa 以上的活性远不如分子量在1～2 kDa 的，推测可能原因为多糖分子量越大，越不容易与靶蛋白结合，而多糖分子量太小又容易导致在胃、肠道中被分解、吸收，而难以分布到靶蛋白周围［23］。

甜味值越高，糖类成分含量越高；酸味值越高，酚酸类成分峰面积越大，药效越高。芦根鲜品在制备成芦根饮片后，氨基酸、苷类、生物碱、苯丙素类成分含量会降低，而氨基酸含量降低可能是导致鲜味值下降的原因［24］。在芦根饮片制备成芦根水提冻干粉后，生物碱、部分苯丙素、芦根多糖1600 等成分含量会降低，而分子量小于1 kDa 的低聚糖、单糖等成分含量会增加，多糖分解为低聚糖、单糖可能是导致甜味增加的原因。

在本研究中，亲水作用色谱供试品含量为反相色谱的10%，而所分析出成分数量与反相色谱的相近，一方面说明亲水色谱串联质谱分析方法具有很高的灵敏度，这是因为亲水作用色谱高比例有机相在质谱中湮灭易产生“库仑爆炸” 效应从而带有高电荷响应［25］。另一方面说明亲水色谱与反相色谱联用，可以很好地改进对强极性亲水性化学成分分析方法，扩展目前药食同源、鲜药、中药成分分析的范围。