糖通饮对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化的延缓作用

陈洪民，潘艳伶，伏红颖，杨 红，凌湘力

（1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004）

糖尿病肾病不仅是糖尿病的主要并发症之一，也是终末期肾脏病的主要原因［1-2］。肾脏纤维化是糖尿病肾病最主要的病理特征，表现在细胞外基质（ECM） 在肾小球基底膜和肾小管间质中异常沉积［3］。肾脏功能的损伤与肾脏纤维化密切相关，对抗肾脏纤维化是减轻糖尿病肾病的内在机制。但目前临床上尚无治疗肾脏纤维化的特效药物［4-5］。

转化生长因子-β1（TGF-β1） 被认为是作用最强的致纤维化细胞因子，介导多种信号参与肾脏纤维化的过程［6］。研究表明，microRNA-21 （miRNA-21） 亦与肾脏的纤维化相关，miRNA-21 基因缺失能够抑制糖尿病肾病小鼠的肾脏纤维化，其机制可能与调控TGF-β1及相关基质蛋白有关［7］。

“糖通饮” 是全国名中医凌湘力教授临床治疗糖尿病肾病所创建的经验方。课题组在前期研究中已证实糖通饮对糖尿病肾病大鼠肾脏功能具有保护作用［8-9］，但其具体机制尚未完全明确。故本研究拟通过观察糖通饮对糖尿病肾病大鼠肾脏miRNA-21、TGF-β1的影响，初步探讨糖通饮延缓糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化来保护肾脏的作用机制，以期为临床防治糖尿病肾病，延缓肾脏纤维化提供新的选择，并进一步从分子生物学层面揭示其作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量（180±20） g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK （辽） 2020-0001。大鼠饲养于贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，温度22～26 ℃，相对湿度40%～60%，自由摄水摄食。实验经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准（审批号2000575）。

1.2 药物 糖通饮颗粒制剂由广东一方制药有限公司提供，由生地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、丹皮、黄芪、丹参、地骨皮、草决明组成，将20.69 g 糖通饮颗粒制剂充分溶于23 mL 去离子水中，生药质量浓度为6 g／mL （20.69 g 糖通饮颗粒制剂即一剂糖通饮生药剂量）。厄贝沙坦片（国药准字J20171089），由法国Sanofi 公司提供，使用去离子水制成质量浓度为2 mg／mL 的母液。

1.3 试剂 链脲佐菌素（STZ，货号V900890）购自美国Sigma 公司；尿蛋白定量试剂盒（货号C035-2-1） 购自南京建成生物工程研究所；逆转录试剂盒（货号11141ES10）、PCR 荧光定量试剂盒（货号1184ES25） 购自上海翊圣生物科技有限公司；miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒 （货号R11068.5） 购自广州锐博生物技术有限公司；一抗（兔抗鼠） TGF-β1（货号EPR21143）、Smad2（货号EP784Y）、Smad3 （货号EP568Y） 购自英国Abcam 公司；Col-Ⅲ （货号22734-1-AP）、FN（货号15613-1-AP）、GAPDH （货号HRP-60004）、二抗（羊抗兔） HRP 标记lgG （货号SA00001-2）购自武汉三鹰生物技术有限公司；ECL 超敏化学发光液（货号H31500-1） 购自常州天地人和生物科技有限公司；改良Masson 三色染色试剂盒（货号G1346） 购自北京索莱宝科技有限公司；免疫组织化学链霉亲和素-过氧化物酶两步法检测试剂盒（货号PV-9000）、二氨基联苯胺显色液（货号ZLI-9018） 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 仪器 稳豪倍易型血糖仪（美国Johnson ＆Johnson 公司）；Cobasc702 型全自动生化分析仪（瑞士Roche 公司）；CFX96 型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad 公司）；Tanon-5200 型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；BX53 型生物显微镜（日本Olypums 公司）。

2 方法

2.1 糖尿病肾病大鼠模型复制 将大鼠适应性喂养1 周后，随机抽取10 只为正常组，给予基础饲料喂养8 周；其余50 只大鼠为造模组进行糖尿病肾病造模，给予高脂高糖饮食（常规饲料58%、精炼猪油20%、糖20%、胆固醇2%），喂养8 周。相应饲料喂养结束后，禁食不禁水12 h，造模组大鼠腹腔注射含1% STZ 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5），正常组大鼠腹腔注射柠檬酸钠缓冲液，注射3 次，剂量分别为20、25、30 mg／kg，每次间隔72 h。造模组大鼠于第3 次注射结束72 h 后，连续3 次（每次间隔24 h） 检测空腹血糖，若大于16.7 mmol／L，且伴有饮水量、尿量增加，判定大鼠糖尿病模型造模成功。继续给予高脂高糖饮食喂养3 周，每周固定时间监测空腹血糖，代谢笼收集24 h 尿液检测24 h 尿蛋白定量，若24 h 尿蛋白≥30 mg，则判定大鼠糖尿病肾病模型造模成功［10］。

2.2 分组与给药 大鼠糖尿病肾病模型造模成功后，随机分为模型组，糖通饮低、中、高剂量组，厄贝沙坦组，每组10 只。糖通饮低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予糖通饮颗粒制剂6.21、12.42、24.84 g／kg，每天1 次，连续8 周（大鼠用量按人与动物体表面积的等效比值表折算，分别为成人用量的0.5、1、2 倍）；厄贝沙坦组大鼠灌胃给予13.5 mg／kg 厄贝沙坦片溶液，每天1 次，连续8 周（为成人等效剂量）；正常组与模型组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，连续8 周。给药期间，各组大鼠均以基础饲料喂养，自由摄水摄食。

2.3 生化指标检测 给药8 周后，代谢笼收集24 h尿液并采用全自动生化分析仪检测各组大鼠尿微量白蛋白水平；禁食不禁水12 h，尾静脉取血测空腹血糖后，腹腔注射10% 水合氯醛3 mL／kg 麻醉，股动脉取血，离心取血清，全自动生化分析仪检测各组大鼠空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平；迅速摘取左、右肾组织并称定质量，一部分置于4%多聚甲醛中固定，其余置于-80 ℃冰箱中冷冻保存。

2.4 HE、Masson 和免疫组织化学染色观察大鼠肾组织病理学变化 取4%多聚甲醛固定的大鼠肾组织，制成4 μm 的石蜡切片，严格按照相关试剂盒说明书进行HE 和Masson 染色，观察各组大鼠病理学形态。采用免疫组化SP 二步法，将石蜡切片脱腊、水化及微波炉抗原修复，3%H2O2孵育，加入一抗TGF-β1（1 ∶25）、FN （1 ∶50）、Col-Ⅲ（1 ∶50），4 ℃孵育过夜。PBS 洗涤后，二抗孵育，DAB 溶液显色，显微镜下观察并采集图像。

2.5 RT-qPCR 法检测大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表达 TRIzol 法提取各组大鼠肾组织总RNA，分光光度法检测并计算其含量及浓度。由上海生工工程技术有限公司设计合成 TGF-β1、FN、Col-Ⅲ引物，见表 1，用YEASEN 试剂盒进行逆转录合成cDNA；由广州锐博生物技术有限公司设计合成miRNA-21 引物，RiboBio 试剂盒进行逆转录合成cDNA，步骤及反应体系均严格按照相关试剂盒说明书操作。PCR扩增条件为50 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；95 ℃2 s，60 ℃20 s，70 ℃10 s，40 个循环；70 ℃10 min。以U6 和GADPH为内参，记录各样本CT值，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达，重复3 次。

表1 引物序列Tab．1 Primer sequences

2.6 Western blot 法检测大鼠肾组织TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表达 取0.1 g 肾组织，加入500 μL RIPA 裂解液研磨，离心取上清，BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。加入1.5×上样缓冲液，煮沸后，经SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白并转移至PVDF 膜，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，1×TBST洗膜3 次，加入兔抗鼠GAPDH （1 ∶7 000）、TGFβ1（1 ∶1 000）、FN （1 ∶500）、Col-Ⅲ（1 ∶500）一抗，在4 ℃下孵育过夜，次日TBST 洗膜3 次，加入山羊抗兔IgG-HRP 二抗稀释液，室温孵育1 h，ECL 显影，Tanon 凝胶成像系统扫描成像，采用Image J 软件对条带进行分析，以GAPDH 为内参，计算TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白相对表达。

2.7 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素ANOVA 检验，组间比较两两采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 糖通饮对大鼠肾脏肥大指数、空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾脏肥大指数、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，糖通饮各剂量组大鼠肾脏肥大指数、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平降低（P＜0.05），厄贝沙坦组大鼠肾脏肥大指数、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平降低（P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠肾脏肥大指数、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平变化（±s，n＝6）Fig．1 Changes in the renal hypertrophy index，FBG，24 h ALB，BUN and SCr of rats in each group （±s，n＝6）

3.2 糖通饮对大鼠肾组织病理形态学的影响 正常组大鼠肾脏结构排列完整清晰；模型组大鼠可见肾小球系膜增生明显，基底膜增厚，肾小球体积增大，肾小管萎缩，管腔狭窄；糖通饮各剂量组及厄贝沙坦组大鼠的病变程度均降低，见图2。与正常组比较，模型组大鼠肾小球内及肾小管间质蓝色物质呈强阳性，胶原纤维增多（P＜0.05）；与模型组比较，糖通饮中、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠蓝色物质减少（P＜0.05），色浅，胶原沉积减少，见图3。

图2 各组大鼠肾组织HE 染色（×400）Fig．2 HE staining of rat kidney tissues in each group（×400）

图3 各组大鼠肾组织胶原沉积情况（×400，±s，n＝6）Fig．3 Collagen deposition of rat kidney tissues in each group （×400，±s，n＝6）

3.3 糖通饮对大鼠肾组织TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表达的影响 正常组大鼠肾组织TGF-β1主要在肾小管上皮细胞胞质、肾小球系膜区有少量表达，FN、Col-Ⅲ主要在肾小管、肾小管间质表达，肾小球内也有少量表达，均呈棕黄色颗粒或团块散在分布；与正常组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表达升高（P＜0.05），颜色深；与模型组比较，糖通饮中、高剂量组与厄贝沙坦组大鼠肾组织TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表达降低 （P＜0.05），见图4。

图4 各组大鼠肾组织TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表达（×400，±s，n＝6）Fig．4 Protein expressions of TGF-β1，Col-Ⅲand FN of rat kidney tissues in each group （×400，±s，n＝6）

3.4 糖通饮对大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，糖通饮低剂量组大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表达差异无统计学意义 （P＞0.05），糖通饮中、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表达降低（P＜0.05），见图5。

图5 各组大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FN mRNA 表达（±s，n＝6）Fig．5 mRNA expressions of miRNA-21，TGF-β1，Col-Ⅲand FN of the rat kidney tissues in each group （±s，n＝6）

3.5 糖通饮对大鼠肾组织TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表达升高 （P＜0.05）；与模型组比较，糖通饮低剂量组大鼠肾组织TGFβ1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表达无显著差异（P＞0.05），糖通饮中、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠肾组织TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表达降低 （P＜0.05），见图6～7。

图6 各组大鼠肾组织TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白条带图Fig．6 Bands of TGF-β1、Col-Ⅲand FN proteins of the rat kidney tissues in each group

图7 各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表达（±s，n＝6）Fig．7 Protein expressions of TGF-β1、Col-Ⅲand FN of the rat kidney tissues in each group （±s，n＝6）

4 讨论

在祖国医学中，没有关于糖尿病肾病的病名记载，但根据其临床表现，当属中医学消渴并“虚劳” “肾劳” “水肿” 等范畴。全国名中医凌湘力教授认为糖尿病肾病是由糖尿病发展演变而来的一种虚实夹杂的并病，其基本病机以气阴两虚为本，痰瘀浊毒阻络为标。据此创建经验方“糖通饮”，方中君药黄芪及臣药山萸肉、生地黄、山药可补肝肾、调气阴以固本；佐使药配以地骨皮、茯苓、草决明、丹参、丹皮、泽泻，以祛痰瘀浊毒，疏通肾络，诸药合用补泄兼施，标本同治。临床使用能有效控制糖尿病肾病患者血糖，降低蛋白尿，保护肾与模型组比较，＃P＜0.05。功能，延缓糖尿病肾病进展［11-12］。

糖尿病肾病作为糖尿病严重的微血管并发症之一，肾脏纤维化是最重要的病理生理过程［13-14］。早期可见ECM 过度沉积、肾小球基底膜增厚，大量胶原沉积，逐渐出现肾小球硬化及肾脏纤维化［15］。该病理过程与糖尿病肾病严重程度相关，是其进展的标志，现代医学主要通过控制血糖、血压、蛋白尿等手段改善糖尿病肾病状态，但长期预后仍不佳。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂厄贝沙坦即是临床常用于延缓糖尿病肾病肾损伤的用药，具有降压、减轻尿蛋白的作用［16-17］。本研究HE、Masson染色可见，模型组大鼠肾组织系膜细胞增生，基底膜增厚，胶原纤维沉积；24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐降低；而经各剂量糖通饮及厄贝沙坦干预后，均能不同程度减轻其肾脏病理损伤，延缓肾脏纤维化进展，且中剂量糖通饮即能取得与厄贝沙坦相似的疗效，并拥有厄贝沙坦单用所不具备的改善血糖作用。

糖尿病肾病肾脏纤维化机制复杂，多种细胞因子和信号通路的激活参与了其发病过程。其中TGF-β1被认为是肾小球硬化和肾小管间质纤维化机制中最关键的细胞因子［18］，他能通过激活其下游因子，刺激ECM 生成并抑制其降解，促进肾脏纤维化［19］。同时miRNA-21 的表达亦与肾脏纤维化相关，miRNA-21 上调可促进肾脏纤维化，其机制可能依赖与TGF-β1及其相关通路的协同作用［20-22］。故为了进一步验证糖通饮延缓肾脏纤维化的机制，本研究检测miRNA-21、TGF-β1以及ECM 主要成分蛋白FN、Col-Ⅲ表达，结果发现，与正常组比较，模型组大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表达升高；而经过药物干预，除糖通饮低剂量组对以上指标影响不显著，糖通饮中、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠肾组织miRNA-21、TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表达均降低，组间差异不显著。由此可知，糖通饮对肾脏纤维化的影响可能与下调miRNA-21、TGF-β1表达相关。

综上所述，糖通饮能够延缓糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化，保护肾脏功能，且使用中剂量糖通饮时即可产生较佳效果，其机制可能是通过对miRNA-21、TGF-β1的调控，减少ECM 的沉积产生的。