罗志梅,刘虹延,孙得胜
(遵义医科大学附属医院 1.呼吸与危重症医学科,2.中医科,贵州 遵义 563003)
基因治疗是借助载体把特定的基因序列导入靶细胞,通过对某种基因进行敲减或者过表达,发挥其相应的功能,达到对相关疾病进行治疗的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)因其能够长时间稳定表达、对机体无致病性、良好的安全性等优点,渐渐被更多的研究人员青睐,已成为当前基因治疗研究领域中最热门的载体之一[1]。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)分为多个不同的血清型,不同分型的AAV对其相应的特定组织有特殊的亲嗜作用,如AAV1对血管组织有特殊的亲嗜特性。如果以AAV1作为载体,联合气道内给药方式,有望构建肺血管基因干预模型。因为在这种情况下,经气道输入的药物会主要分布于肺部血管,复制肺血管疾病模型的效果远远优于传统的使用慢病毒载体或全身基因敲除方法及经血管注药等给药方式。
肺动脉高压的特点是肺动脉及右心室收缩压升高,常常引起右心功能不全,预后较差,还往往存在肺远端小血管的重塑[2-5]。本课题组前期实验显示,转录因子KLF4可能在肺动脉高压的起病中扮演重要角色。肺动脉高压模型组发生肺血管重塑的肺动脉中的KLF4表达明显升高,与此同时,标志肺动脉平滑肌细胞增殖水平的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)也明显增多。体外研究还发现,KLF4通过调节AKT的磷酸化影响肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移[6]。而沉默KLF4基因,能够有效地阻止肺动脉平滑肌细胞的失控性增殖和迁移,所以进一步探讨敲减肺血管中的KLF4,并检测相应指标,观察其能否有效地缓解肺动脉高压势在必行。
本研究拟将已验证有效的KLF4小干扰链与AAV1病毒载体结合,构建沉默KLF4基因的重组腺相关病毒载体,进一步扩增、包装病毒载体,并在长时间(3个月)香烟烟雾刺激诱导的肺动脉高压动物模型中使用,为后期KLF4基因敲减在大鼠肺动脉高压中的预防和治疗作用,以及相关分子机制的深入研究奠定基础。
1.1.1 实验材料 载体pHBAAV-U6-MCS-CMVEGFP(上海汉恒科技公司),大肠杆菌菌株DH5α(上海汉恒科技公司),限制性内切酶(上海Thermo公司),T4连接酶(上海Fermentas公司),凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物公司),琼脂糖/粉(上海生工生物工程股份有限公司),DNA ladder(江苏康润生物科技公司),KLF4的小干扰序列(武汉聚能生物公司),胎牛血清(上海Gibco公司),胰蛋白酶(上海Thermo公司),质粒DNA大量抽提试剂盒(北京Tiangen公司),腺相关病毒纯化试剂盒(上海Biomiga公司),LipofiterTM(上海汉恒生物科技公司),Benonase(上海Sigma公司),真核转染试剂(上海汉恒科技公司),DNase I(上海Fermentas公司),原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(广州吉尼欧生物公司),AAV-293细胞(上海汉恒科技公司),PowerLab生物数据采集分析系统(澳大利亚ADInstruments公司),香烟烟雾暴露动物染毒系统(本研究团队自主研发,专利号:ZL201820234399.3)。
1.1.2 实验动物 36只SPF级成年雄性SD大鼠,8周龄,体重185~225 g,购自湖北实验动物研究中心[实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2015-0018]。模型复制、测压等动物实验操作均在华中科技大学附属同济医院实验动物中心进行[实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2021-0057]。本研究由华中科技大学附属同济医院动物实验伦理委员会批准。
1.2.1 确定siRNA序列 根据本课题组前期研究结果[6],设计针对大鼠KLF4基因特异性的siRNA序列,基于siRNA序列(GenBank Acc.NM_053713.1)进行KLF4 shRNA的设计,并采用ELBASHIR等[7]报道的方法进行筛选,得到沉默效果理想的siRNA序列5'-CACCCACACTTGTGACTAT-3'。本研究选用的阴性对照序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3'。
1.2.2 通过酶切技术构建病毒载体 以pHBAAVU6- MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP。具体方法:根据之前实验中筛选的有效靶点合成相关引物,然后进一步退火形成双链片段,用EcoRI、BamHI酶切载体通过琼脂糖凝胶电泳检测产物,在凝胶切下目标载体条以回收凝胶,把siRNA目的序列插入U6启动子之后来调控其表达,得到连接的产物,将其转化到大肠杆菌dh5a的感受态细胞中,并把克隆进行测序及比对[8]。
1.2.3 载体测序鉴定 转化后的KLF4-shRNA平板挑菌,37 ℃ 250 r/min摇菌14 h,对细菌溶液进行测序,并通过DNA测序进行验证。
1.2.4 载体包装、扩增及纯化 重组质粒pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP、包装质粒pAAV-RC及辅助质粒pHelper共转染AAV-293细胞,得到表达 EGFP 和KLF4-shRNA 的AAV1。对构建的辅助质粒及载体进一步提取,浓度超过1 g/L,A260/280在1.7~1.8可用于病毒包装。将用于包装的细胞株AAV-293细胞以DMEM + 10% FBS,37 ℃,5% CO2,相对湿度95%的条件培养。重组病毒颗粒的纯化参照文献[9]的方法进行。
1.2.5 载体滴度测定 通过PCR检测确定包装好的病毒载体的滴度。通过检测病毒基因组中rAAV载体的基因组拷贝数来测定rAAV的病毒颗粒数,滴度单位用v.g./mL来表示。参照标准品来描绘标准曲线,计算AAV病毒滴度。
1.2.6 动物模型复制及治疗干预 采用随机数字表法将36只SD大鼠随机分为对照组(6只)和香烟烟雾刺激组(30只)。置于本课题组自行研制的香烟烟雾染毒箱系统内,参考本课题组之前的方法进行香烟烟雾刺激[10],香烟烟雾刺激复制模型3个月后,将香烟烟雾刺激组27只大鼠(前段实验中接受烟雾刺激的大鼠死亡3只)随机分为生理盐水模型组、对照病毒模型组(AAV1-control vector)、治疗干预组(AAV1-KLF4-shRNA)组,每组9只。治疗干预组和对照病毒模型组分别经气道给药125 μL/只、100 μL/只。继续按前述香烟烟雾刺激方法复制模型1个月。健康对照组大鼠不做任何处理。
1.2.7 右心导管法检测血流动力学指标 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。进入麻醉状态后,把大鼠固定在手术台上,小心暴露气管后,进行气管内插管,把气管内导管与小动物呼吸机连接。潮气量为2 mL/100 g,呼吸频率设为70次/min,呼吸比为1∶1。采用右心导管法检测血流动力学指标,具体方法:切开大鼠的颈部皮肤,分离大鼠颈静脉,结扎静脉远端,在静脉的近心端剪一楔形口,随之顺势将内置有导丝的测量管插入(导管末端连接探测仪),并轻轻地向前推进,后经锁骨下静脉进入右心房,然后缓慢进入右心室,此时可见导管内有血液回流,立即退出导丝,观察波形并调整导管方向,待波形呈典型右心室压力波形并稳定后记录,最后以PowerLab软件分析右心室收缩压和平均右心室压。
数据分析采用Graph Pad Prism 8.0统计软件。计量资料以均数±标准差(±s)表示,比较用方差分析,进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
与对照病毒载体siRNA相对应的shRNA序列见表1;KLF4-shRNA序列见表2。
表1 与对照病毒载体siRNA相对应的shRNA序列
表2 与对照病毒载体siRNA相对应的KLF4-shRNA序列
KLF4-shRNA测序结果(下划线为目的序列)。
CGGTGAGATTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTT GTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGCAC CCACACTTGTGACTATTTCAAGAGAATAGTCACAAGT GTGGGTGTTTTTTGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGAT AACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGG AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTC AATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGG TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATA TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTA AATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTT ATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTA GTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGT ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGG GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG TTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGC GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGA GCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTG GTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAAC GGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGC GATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCT GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCC TCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAG CCGCTACCCCGACCA
对插入片段与测序结果比对,结果证实所选送测序的重组载体碱基序列完全正确,位于测序图中62~120位(59个碱基)(见图1)。
图1 KLF4-shRNA测序结果
根据实时荧光定量PCR结果绘制标准曲线,以每组AAV标准品的Ct(average)为纵坐标Y,取其对应的拷贝数的对数为横坐标X,计算出标准曲线的函数公式及R方值。R2=0.9909。见图2。
图2 根据实时荧光定量PCR结果绘制的标准曲线
通过比对标准曲线计算病毒基因组拷贝数,将待测AAV样品Ct均值代入公式中测定结果:
HBAAV2/1-r-KLF4 shRNA1-GFP滴度=107.48×40 000=1.2×1012v.g./mL
对照病毒HBAAV2/1-GFP滴度=107.58×40 000=1.5×1012v.g./mL
给予香烟刺激的3组大鼠明显倦怠、少动。将熏烟的大鼠再次分组后的1个月期间,生理盐水模型组和对照病毒模型组分别死亡2只大鼠,治疗干预组有1只死亡。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,经方差分析,差异均有统计学意义(P<0.05)。进一步两两比较结果:生理盐水模型组和对照病毒模型组大鼠的右心室收缩压和平均右心室压较健康对照组升高(P<0.05);治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压较生理盐水模型组和对照病毒模型组降低(P<0.05)。见表3。
表3 4组大鼠右心室收缩压和平均右心室压的比较(mmHg,±s)
表3 4组大鼠右心室收缩压和平均右心室压的比较(mmHg,±s)
注:①与健康对照组比较,P <0.05;②与治疗干预组比较,P <0.05。
平均右心室压14.6±4.7 24.4±4.5①②23.7±5.8①②13.5±2.8 9.381 0.000组别健康对照组生理盐水模型组对照病毒模型组治疗干预组F 值P 值n6 7 7 8右心室收缩压20.0±2.7 40.1±8.5①②44.9±10.7①②25.9±5.2 17.570 0.029
作为一种常见的肺血管疾病,肺动脉高压目前尚无效果好、副作用小的理想药物,口服药或者静脉用药因药物需要进入血液循环,常常伴随其他脏器的副作用,引起不良反应。而呼吸科常用的雾化吸入等局部气道给药方式,虽然只主要作用于肺脏局部,但常常药物只是沉积于气管和肺泡组织,不容易有效作用于肺部血管。近年来研究发现,1型腺相关病毒(AAV1)对血管有特殊的亲嗜性,以AAV1为载体携带特定基因,经气道注药,可以靶向作用于肺血管[11-12]。
本研究构建了一种带有GFP荧光标记的靶向沉默KLF4基因的重组腺相关病毒rAAV1-KLF4-shRNA,将其转染到大鼠肺动脉中,结合本课题组既往研究证实在KLF4基因敲除的大鼠肺动脉高压明显改善[6],本研究中转染KLF4干扰腺病毒载体的动物模型血流动力学明显改善,进一步证明了转染KLF4干扰腺病毒载体对改善香烟烟雾诱导的大鼠肺动脉高压有效果,从侧面进一步说明病毒载体构建成功。因为AAV1对血管组织具有特殊的亲和力,而且本研究采用了经气管给药的操作,所以rAAV1-KLF4-shRNA在肺血管中能够稳定地发挥作用。
本研究把空载体经EcoRI和BamHI酶切,接着将siRNA目的序列插入到U6启动子,调控其表达,此病毒载体含有CMV启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达;而GFP的表达受CMV启动子调节,通过观测GFP的表达,可以判断相关病毒载体在体内的转导效率。测序检测的结果表明,本研究获得的载体序列是正确的。
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中,在每个PCR循环后使用荧光化学物测量产物量的实验检测手段。PCR扩增的过程中,掺入荧光染料,然后经染料发出的信号实时检测PCR的过程。由于在扩增的指数阶段,模板Ct值和该模板的初始拷贝数之间呈线性关系,所以成为定量的依据。本研究通过SYBRGreen I法来检测AAV基因组的含量,并最终计算出所制备的AAV的具体滴度。
本研究中利用了AAV1对血管组织有特殊的亲嗜特性这一特点,联合气道内给药的用药方式,进行治疗干预。首先,实验结果显示,生理盐水模型组和对照病毒模型组大鼠的右心室收缩压和平均右心室压均比健康对照组升高,按肺动脉高压动物模型的研究惯例[5,13],可认为肺动脉高压模型复制成功。同时,治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压较生理盐水模型组和对照病毒模型组降低,提示AAV1-KLF4-shRNA治疗干预有效,表明这种靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体可以在肺动脉高压动物模型的治疗中发挥作用。
AAV因着具有免疫原性低、表达时间长、有组织选择性、亲和特性等优点,近些年越来越多地被用作基因治疗的载体,已经成为当前最有前景的基因治疗工具之一[14-23]。AAV整合到宿主的基因组中的概率很低[24],与腺病毒、慢病毒等广泛应用于基因治疗的其他常用病毒载体相比,AAV几乎不会引起炎症反应,对人体无致病性[17,25]。迄今为止,尚未发现AAV与人类的疾病有关。基于上述优点,AAV在近几年也逐渐被用于临床患者的基因治疗[26],包括首例以AAV1为病毒载体的基因治疗[27]。
综上所述,本研究成功构建了靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并证实其在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展有关AAV1-KLF4-shRNA在肺动脉高压中的预防和治疗作用及相关分子机制的深入研究提供了基础条件。