MicroRNA-29a与冠心病心绞痛患者血管内皮损伤及斑块不稳定性的相关性*

林红丽，张雪菲，彭慧，黄倩倩，张月辉

[青岛市中医医院（青岛市海慈医院） 干部保健科，山东 青岛 266033]

既往多项研究证实，microRNA-29a（miR-29a）参与机体多系统疾病如肾小球病变[1]、脓毒症[2]、神经元细胞凋亡[3]等；动物实验证实，敲除miR-29a小鼠出现蛋白尿，且肾小球损伤及肾脏纤维化程度加剧[1]。临床数据表明，早期脓毒症患者外周血中检出miR-29a表达明显上调，是潜在的诊断脓毒血症的生物标志物，可能也具有预测脓毒症患者临床预后的价值[2]。随着研究的深入，发现miR-29a参与冠心病发生、发展，是临床诊断冠心病的有益生物学标志物，与健康对照组相比，miR-29a在冠心病患者中表达增加，且参与冠心病病情进展，影响患者心功能，分析机制可能与miR-29a影响机体炎症反应有关[4]。笔者回顾文献发现，miR-29a对冠心病的影响可能与其参与冠状动脉粥样斑块的发生、发展有关。查晴等[5]发现，冠状动脉粥样斑块中miR-16的表达显著上调，进一步的病理学机制研究发现，miR-16促进血管内皮炎症反应，加剧泡沫细胞凋亡。目前针对miR-29a与斑块稳定性及冠脉血管内皮损伤的相关性研究尚属空白，阐明miR-29a参与上述病理过程的机制能够为临床治疗冠心病提供新的分子靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象

连续纳入2020年4月—2022年6月于青岛市中医医院心血管内科门诊住院的冠心病患者120例。其中，男性68例，女性52例；年龄46～81岁，平均（59.03±8.27）岁。纳入标准：①患者符合冠心病诊断[6]；②首次诊断冠心病且自愿入组；③稳定型心绞痛定义为特定劳力状态下导致胸闷和（或）胸痛等症状；④不稳定型心绞痛。排除标准：①合并急性心肌梗死（包括急性ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型心肌梗死）；②存在抗血小板、调脂等药物治疗禁忌证；③合并其他系统恶性肿瘤、严重肝肾功能不全等不适宜入组疾病；④既往接受过冠状动脉介入治疗；⑤临床资料不完整；⑥存在先天性心脏病、反复且难以控制的心力衰竭及其他累及心血管系统的疾病；⑦虽有冠状动脉血管病变，但平素无心绞痛等临床症状；⑧妊娠或哺乳期妇女。所有患者自愿入组，入组前获得充分知情同意，并签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会审查批准（No：20221014002）。

1.2 检测方法

1.2.1 样本收集 抽取受试者禁食12 h后外周静脉血，3 000 r/min离心5 min，收集上层血清用于实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），同时抽取禁食12 h后静脉血用于检测血脂水平。

1.2.2 qRT-PCR检测miR-29a表达 取冻存血清室温完全解冻后加入TRIzol试剂提取总RNA，通过紫外分光光度仪在波长260 nm处检测总RNA浓度和纯度合格[4]，备用实验。应用miScript Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）构建cDNA文库，应用TaqMan®Fast Advanced Master Mix试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）进行qRT-PCR，配制总体积为20 μL的反应体系：包括5 μL cDNA，10 μL Master Mix，正向引物和反应引物各1 μL（上海生工生物工程股份有限公司），3 μL RNA-free水。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共40个循环。以U6为内参基因。miR-29a正向引物：5'-CGCGGATC CATGGTTAAAGAGCC-3'；反向引物：5'-CCCAAGCTT TCAGTATAACCATTC-3'，引物长度23 bp；U6正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，引物长度25 bp。miR-29a mRNA相对表达量的计算方式为2-ΔΔCt，每个样本均重复检测3次，取平均值。

1.2.3 ELISA法检测内皮细胞特异性分子-1（endothelial cell specific molecule-1,ESM-1）、内皮素-1（endothelin-1,ET-1）、一氧化氮（nitric oxide,NO）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1） 取1.2.1中血清，采用ELISA法检测内皮细胞ESM-1、ET-1、NO、TNF-α、ICAM-1[7]，检测试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2.4 实验室检查 抽取受试者空腹静脉血约5 mL送检至本院中心实验室，检测低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglycerides,TG）及血肌酐（serum creatinine,Scr）。

1.2.5 冠状动脉CT血管成像检查评估冠状动脉粥样硬化斑块性质 根据冠状动脉CT血管成像评价冠状动脉粥样硬化斑块的稳定性[7]，计算斑块CT值，其中CT值< 60 HU为软斑块，60 HU≤ CT值<130 HU为纤维斑块，CT值≥ 130 HU为钙化斑块。应用宝石能谱CT进行冠状动脉成像检查（德国西门子公司），扫描范围设定为主动脉弓肺动脉起始段至膈肌下1 cm。参数设置：管电压为120 kV，管电流为800 mA，螺距为0.5 mm，层厚0.625 mm，经肘正中静脉推注对比剂，注射速度3.5 mL/s；依据冠状动脉CT血管成像检查将冠状动脉粥样斑块分为稳定斑块（钙化斑块和硬斑块）及不稳定斑块（软斑块和混合斑块）[8]。

1.3 分组

根据miR-29a mRNA中位数（miR-29a mRNA=1.13）对患者进行分组，外周血miR-29a mRNA>1.13的患者归为高miR-29a组（59例），外周血miR-29a mRNA≤1.13的患者归为低miR-29a组（61例）。根据患者斑块性质，将患者分为软斑块（51例）、纤维斑块（37例）及钙化斑块（32例）。根据斑块稳定性，将患者分为斑块稳定组（82例）与斑块不稳定组（38例）。根据患者临床表现将患者分为稳定型心绞痛组（74例）与不稳定型心绞痛组（46例）。

1.4 统计学方法

数据分析均采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ²检验；相关性分析用Pearson法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料及实验室指标比较

高miR-29a组与低miR-29a组的年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症、LDL-C、HDL-C、TG、TC、Scr比较，经t检验或χ²检验，差异均无统计学意义（P>0.05）。高miR-29a组与低miR-29a组的NO、ET-1、ESM-1、TNF-α及ICAM-1水平比较，经t检验或χ²检验，差异均有统计学意义（P<0.05），高miR-29a组的NO、ET-1、ESM-1、TNF-α及ICAM-1水平高于低miR-29a组（P<0.05）。见表1。

表1 两组患者临床资料及实验室指标的比较

2.2 miR-29a与斑块稳定性、不稳定型心绞痛及斑块性质的关系

qRT-PCR结果显示，稳定斑块组与不稳定斑块组miR-29a mRNA相对表达量分别为（1.42±0.51）、（2.09±0.33），经t检验，差异有统计学意义（t=4.933，P=0.000）；不斑块稳定组外周血miR-29a mRNA相对表达量高于斑块稳定组。

qRT-PCR结果显示，不稳定型心绞痛组与稳定型心绞痛组miR-29a mRNA相对表达量分别为（2.27±0.41）、（1.58±0.36），经t检验，差异有统计学意义（t=5.656，P=0.000）；不稳定型心绞痛组外周血miR-29a mRNA相对表达量高于稳定型心绞痛组。

qRT-PCR结果显示，软斑块组、纤维斑块组、钙化斑块组的miR-29a mRNA相对表达量分别为（2.41±0.43）、（1.94±0.29）、（1.25±0.27），经方差分析，差异有统计学意义（F=4.053，P=0.000）。软斑块组外周血miR-29a mRNA相对表达量高于纤维斑块组及钙化斑块组（P<0.05）；但纤维斑块组及钙化斑块组外周血miR-29a mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 miR-29a与冠状动脉血管内皮因子的相关性

Pearson相关性分析结果提示，miR-29a与ET-1、TNF-α及ESM-1呈正相关（r=0.471、0.605和0.328，P=0.000、0.041和0.000），但与NO呈负相关（r=-0.291，P=0.034）。

3 讨论

血管内皮损伤是指内皮功能或正常形态受到损伤时出现功能障碍及变形，导致机体炎症反应、血栓聚集、氧化应激及血管收缩等病理过程显著加强，也是动脉粥样硬化的始动因素。持续的内皮细胞损伤最终导致动脉粥样硬化[9-11]，因此探讨影响血管内皮损伤的机制有利于降低动脉粥样类疾病的病程进展和恶性事件风险。孙定军等[12]研究发现，miR-29a-3p调控细胞凋亡等病理生理过程，抑制miR-29a-3p降低了ox-LDL所致的血管内皮细胞氧化应激和凋亡，以上结果提示临床通过靶向干预miR-29a-3p治疗动脉粥样硬化类疾病有理论基础支撑。本研究则从临床病例出发，探讨了miR-29a在冠心病心绞痛患者中的表达变化，及其与血管内皮损伤程度、斑块稳定性、心绞痛发作情况的相关性，为后续开展基因靶向治疗提供理论基础。

本研究结果显示，高miR-29a组ESM-1、ET-1、NO、TNF-α均高于低miR-29a组；且miR-29a与ET-1、TNF-α及ESM-1呈正相关，与NO呈负相关。说明循环miR-29a水平可能是反应冠状动脉血管内皮损伤程度的指标，提示miR-29a可能具备潜在的损伤冠脉血管内皮，加剧病程进展的不利影响因素，与既往研究结果一致[13]。比较可知，斑块不稳定患者miR-29a水平高于斑块稳定患者，不稳定型心绞痛患者miR-29a水平高于稳定型心绞痛患者；软斑块患者miR-29a水平高于纤维斑块及钙化斑块患者，结果提示高水平miR-29a提示患者有更多的心血管事件风险，能够帮助临床医师在诊治过程中识别高危患者，积极给予综合干预措施，降低不良心血管事件发生风险。

综上所述，miR-29a与冠心病患者冠脉血管内皮损伤及斑块不稳定性具有相关性，miR-29a表达越高，血管内皮损伤可能越严重，斑块不稳定性风险越大。后续笔者将开展相关研究探讨干预miR-29a对冠心病的影响，为临床转化提供理论依据。