抗菌肽LL-37的生物学活性及其在病毒感染中的发生发展作用

何一秀,王梓良,朱亚非

(1.杭州师范大学附属医院 儿科,浙江 杭州 310015;2.山西医科大学第五临床医学院 心外科,山西 太原 030001)

抗菌肽是存在于人体内的、天然的具有多种生物学活性的小分子肽。迄今已有许多天然的抗菌肽被报道,其中LL-37是目前发现的唯一来源于人的组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)家族成员。现已证实,LL-37具有多种抗感染的生物学活性。本文着重针对LL-37在不同病毒发生发展过程中所起的作用,就目前研究的最新进展进行总结,为研究抗病毒的发生发展和治疗提供新的视角和思路。

1 LL-37的结构与分布

LL-37于1995 年首次被发现,主要由hCAP-18分解产生,后者主要由CAMP基因编码,位于3号染色体的p21位点。该基因由4个外显子和3个内含子组成,其中第4个外显子编码抗菌域[1-2]。LL-37包含C末端的抗菌结构域和N 末端结构域,其命名主要基于N 端前两个氨基酸残基为赖氨酸,且由37 个氨基酸残基组成[1]。N端螺旋主要负责肽寡聚化、抗蛋白酶水解、趋化和溶血活性,而C端螺旋参与抗病原体作用[2]。C末端是形成肽四聚体的关键结构,它有助于激活效应细胞,并有利于与血清成分和细菌外壁相互作用,从而导致肽的滞留,降低其抗病原潜能。LL-37可表达于多种上皮细胞和免疫细胞,当机体感染时,它可以通过免疫细胞趋化作用、调节细胞因子释放、补体系统参与、抑制细胞凋亡等进行调控,是人体固有免疫中重要的多功能分子,在疾病的预防和控制中起着重要作用。

2 LL-37的生物学特性

2.1 免疫调节作用 LL-37可招募效应细胞如中性粒细胞、单核细胞和T淋巴细胞到炎症灶中,通过免疫细胞受体的特定激活来调节获得性免疫[3]。最初,中性粒细胞可合成不活跃的hCAP-18前体并储存在次级颗粒中。通过损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs)或病原相关分子模式(pathogenassociated molecular pattern molecules,PAMPs),激活Toll样受体(Toll-like Receptor,TLRs)和/或细胞因子类型和水平的改变,可促进细胞脱颗粒。在刺激下,hCAP-18被脱颗粒并释放到细胞外[4]。此外,单核细胞、树突状细胞和免疫系统的巨噬细胞被证明能表达LL-37。在炎症过程中,LL-37可以诱导T细胞增殖,显著增加调节性T细胞(regulatory cells,Tregs)的产生,减少外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的促炎因子表达(如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α);这表示当肽发挥自身的抗感染特性时,始终伴有控制性炎症反应,以保护身体免受严重炎症反应的影响[5]。

2.2 抗内毒素作用 LL-37可通过破坏细菌的细胞膜来杀死病原体,并抑制病毒复制,还能与濒死细菌释放的各种成分结合,这些危险分子可以刺激巨噬细胞产生促炎细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α、白介素-8和诱导型一氧化氮,从而引发突然和夸大的炎症反应,导致宿主发病和死亡[6]。LL-37可抑制这种压倒性的免疫反应,并通过中和其内毒素活性来保护宿主免受脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导。像LL-37这样的阳离子肽,能够抑制细菌LPS诱导的促炎反应的能力,很大程度上是通过静电作用与带负电荷的LPS结合[7]。

2.3 抗菌作用 在革兰氏阳性菌中,胞质膜被一层厚的肽聚糖层包围,而革兰氏阴性菌胞质膜被一层薄的肽聚糖层和一层外膜包围,革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞质膜都富含磷脂酰甘油、心磷脂和磷脂酰丝氨酸,这些磷脂具有带负电荷的头部基团,对带正电荷的抗菌肽极具吸引力[8]。

Wang[2]研究发现,在静电作用下,LL-37 可与细胞膜表面带负电荷的细菌结合,由线性结构转变为螺旋结构,可使细菌膜变薄、破裂,从而对革兰阳性菌、革兰阴性菌产生广谱抗菌活性。Wan等[9]研究发现,LL-37可通过dTHP1细胞增强巨噬细胞中IgG Fc受体清除细菌的能力,当THP1 细胞在20 mL LL-37溶液中温育8 h后,免疫球蛋白G可得到加强,来调节大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吞噬能力。其次,LL-37 的构象与其抗菌活性密切相关,因LL-37 分子中的部分氨基酸具有双亲性螺旋结构,在疏水作用下易形成寡聚体。该寡聚体形式的α螺旋结构与机体的抗体活性成正比,即α螺旋结构的寡聚体越多,其抗菌活性越强[10]。

2.4 抗病毒作用 LL-37对多种病毒具有抗病毒活性,其抗病毒活性主要是通过与病毒外膜的相互作用介导[11]。

2.4.1 抗流感病毒 Barlow等[12]研究发现,LL-37对流感病毒(influenza virus,IAV)感染的小鼠有保护作用,且这种抗病毒活性部分是由对病毒粒子的直接作用介导的,通过限制病毒复制和病毒诱导的炎症在体内促进宿主对病毒的防御,且治疗性使用LL-37能够降低流感病毒感染的严重程度,其程度与目前人类一线治疗药物扎那米韦相似。LL-37与防御素不同的是,LL-37不会引起病毒聚集或改变上皮细胞对病毒的摄取,但可通过参与甲酰肽受体-2 (formyl peptide receptor 2,FPR-2)增加中性粒细胞呼吸爆发和中性粒细胞细胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)对IAV的反应,并可能与LL-37在体内IAV感染过程中的保护作用有关[13-14]。研究已发现,在上皮细胞和巨噬细胞中LL-37的表达上调是维生素D依赖的[15]。因此,依赖维生素D上调LL-37可能有助于人体对病毒感染的保护作用。

2.4.2 抗呼吸道合胞病毒 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染是婴儿,特别是早产儿呼吸道疾病的最常见原因之一,目前还没有疫苗或具体有效的治疗方法。在大多数儿童中,毛细支气管炎是一种轻微的自限性感染,但有时也可能在婴儿中进展为呼吸衰竭[16]。

Currie等[17]研究发现,在肺部RSV感染的小鼠模型中,外源性应用LL-37在体内对RSV介导的疾病具有保护作用;在健康的成人RSV感染模型中,较高的鼻腔LL-37水平与保护作用有关;LL-37在体外可直接诱导病毒被膜的损伤,破坏病毒颗粒,减少病毒与人上皮细胞的结合和感染。LL-37水平较低的儿童更容易感染呼吸道合胞病毒,可能增加疾病的严重程度,并且住院时间更长[18]。可见,LL-37是抵抗呼吸道合胞病毒肺部感染的宿主防御的一个关键成分,起着第一接触点抗病毒盾牌的作用,并在减少疾病后果的严重性方面具有额外的后期作用。

2.4.3 抗人类免疫缺陷病毒 先天免疫系统可构成黏膜表面的第一道防线,在急性感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)时具有降低病毒载量的能力。Wong等[19]研究发现,LL-37可以直接与HIV-1逆转录酶结合,以剂量依赖的方式阻断其活性。而且,在单纯疱疹病毒感染的上皮细胞中,通过诱导朗格汉斯细胞中HIV受体的上调,发现LL-37与HIV感染风险的增加密切相关[20]。Tangpricha等[21]研究发现,体外LL-37可抑制外周血单核细胞中的HIV复制,未接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染患者与接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染患者相比,血浆LL-37水平显著降低,这表明抗逆转录病毒治疗可能减少了HIV复制以提高血浆LL-37水平。然而,仍需进一步进行详细的体内动物实验,以确定LL-37对HIV感染的有益效果。

2.4.4 抗丙型肝炎病毒 据估计,全世界有1.6亿多人长期感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),大多数情况下,HCV持续感染可导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的发生[22]。HCV是一种包膜病毒,这意味着病毒粒子含有脂质双层,可以作为LL-37的靶标。Matsumura等[23]研究发现,LL-37在细胞培养中表现出抗HCV的特性,当HCV与LL-37预先孵育并随后用于感染HuH-7细胞时,HCV滴度显著降低。用BE-KO(载脂蛋白B和载脂蛋白E双基因敲除)细胞进行的体外研究表明, LL-37的表达对细胞内HCV的RNA水平没有影响,反而显著增加了细胞外和细胞内的HCV感染滴度。这表明需要进行剂量依赖性的研究,以了解LL-37在HCV复制中的抗病毒作用[24]。

2.4.5 抗单纯疱疹病毒 单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)主要引起口腔皮肤或黏膜的感染,当病毒感染眼睛(疱疹角膜炎),或侵入中枢神经系统、损害大脑(疱疹脑炎)时,就会发生更严重的疾病。免疫系统不成熟或受抑制的患者容易出现严重并发症。

Roy等[25]研究发现:人原代角质形成细胞经LL-37处理1 h后,HSV-1 DNA滴度与未处理细胞比较显著降低;在LL-37存在下感染HSV-1的角质形成细胞显示5个重要的干扰素刺激基因(IFIT1、OAS1、ISG20、IRF7和viperin)的表达增加,尤其是IRF7的表达显著增加,而干扰素-β的表达降低;这表明在体外培养的LL-37处理的角质形成细胞中,IRF7是抑制HSV-1复制的关键调节因子。研究发现,LL-37在体外与病毒粒子预先孵育时可以抑制HSV-1感染,还可将角膜上皮细胞中的病毒滴度降低100倍以上[26]。Ron-Doitch等[27]还成功制备了含LL-37的聚乙二醇化脂质体制剂,可以降低细胞毒性,并具有增强抗HSV-1的生物活性。因此,脂质体LL-37可作为一种潜在的治疗药物用于预防HSV-1感染,然而,这种保护机制仍不清楚。

2.4.6 抗鼻病毒 人类鼻病毒(human rhinovirus,HRV)是病毒性呼吸道感染的最常见原因,虽然在具有免疫能力的宿主中,人鼻病毒感染是温和而自限的,但人鼻病毒感染与婴儿毛细支气管炎、免疫抑制中的肺炎,以及既往存在的肺部疾病如哮喘或慢性阻塞性肺疾病的恶化有关[28]。

研究证明LL-37对HRV有很强的抗病毒活性,其主要作用机制是直接影响病毒;与健康细胞相比,较低浓度的LL-37(≤30 μg/mL) 可显著降低感染细胞的代谢活性,而不会促进细胞凋亡或坏死[29]。Greiller等[30]研究发现维生素D诱导了LL-37和IkBa激酶的表达,并降低了HRV对NF-kB驱动基因的诱导作用,这表明维生素D可以增强对鼻病毒感染的抵抗力。肽基精氨酸脱氨酶(peptidyl arginine deaminase,PAD)可调节所有带正电荷的精氨酸转化为瓜氨酸,导致LL-37对HRV的抗病毒活性显著降低[31]。因此,靶向降低PAD酶可能有助于维持LL-37抗HRV感染的活性。

2.4.7 抗轮状病毒 随着卫生条件的不断改善,轮状病毒成为发展中国家和发达国家5岁以下儿童严重胃肠炎的病原体之一[32]。到目前为止,尚无治疗轮状病毒感染的特定药物,而且在开发新的抗病毒药物方面仍面临许多重大挑战。Hosseini等[33]研究体外LL-37对轮状病毒感染的影响,发现在病毒暴露前用LL-37预处理细胞,可以剂量依赖的方式显著减少感染性病毒粒子的产生,这可能与LL-37结合轮状病毒受体,阻止病毒进入宿主细胞有关,也可能与LL-37促进先天免疫反应抑制轮状病毒感染有关。

2.4.8 抗新型β-冠状病毒 目前,新型β-冠状病毒(SARS-CoV-2)可导致急性呼吸道疾病、肺炎的大流行,甚至死亡[34]。循证研究结果表明,血清25-羟基维生素D水平低与COVID-19疾病发病率或患病率的高风险呈负相关。维生素D可以上调几种抗菌剂,包括LL-37,它可以直接或间接作用于SARS-CoV-2并阻止其复制,增加抗炎细胞因子的产生,降低促炎免疫反应[35]。然而,还需要进一步的随机临床研究来证明LL-37对SARS-CoV-2发病机制和预防的影响。

2.4.9 抗肠道病毒71型 肠道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原体,可导致患儿神经系统和全身并发症[36]。由于缺乏特效抗病毒药物,迫切需要对EV71感染进行有效的抗病毒治疗。近期研究发现,肠病毒71型感染显著诱导神经细胞表达干扰素-β,干扰素-β应答在神经细胞对抗肠病毒71型感染中起重要作用[37]。Yu等[38]测试了 LL-37是否能调节人脑星形胶质细胞中干扰素-β的表达,发现U251细胞与LL-37共孵育后可显著诱导基础干扰素-β的表达,并在EV71感染时轻度增强干扰素-β的表达。且LL-37能有效抑制EV71诱导的U251细胞的CPE和EV71复制,虽对EV71无直接灭活作用,但可有效调节干扰素-β和IL-6应答,并显著抑制病毒结合,可见该抗菌肽在抗EV71感染的抗病毒治疗中是有一定潜力的。

3 展望

抗菌肽LL-37在治疗或预防相关病毒方面,能发挥多大效果,取决于对这些肽具有抗病毒作用的机制、直接杀灭病毒的程度或通过调节先天免疫系统的程度,以及在动物模型和人类疾病的体外观察的生理相关性的深入理解。虽然目前研究还处于早期阶段,但开发针对病毒和这些病原体的天然宿主反应的新型干预措施具有很大潜力,这一领域的新发现很可能会继续快速出现。