脂肪间充质干细胞来源的外泌体在皮肤伤口愈合过程中的作用

胡晓强,张丽君,王 乙,连福治,张 燕

(杭州师范大学 公共卫生学院,浙江 杭州 311121)

皮肤是覆盖于人体表面最大的器官,由表皮和真皮组成,在抵抗微生物入侵、紫外线辐射以及防止水分丢失、调节体温等方面发挥着重要作用。皮肤具有一定的自我修复能力,一般损伤后能够自动愈合。然而糖尿病等慢性疾病患者的皮肤伤口往往较难愈合,不仅影响皮肤正常功能的发挥,而且还会影响美观,给患者生理和心理上造成双重影响[1]。皮肤伤口愈合过程可以分为3个既连续又重叠的阶段——止血/炎症期、增生期和重塑期[2],脂肪间充质干细胞来源的外泌体(adipose-derived stem cells-derived exosomes, ADSCs-Exo)在伤口愈合的不同阶段发挥着不同的作用。ADSCs-Exo不仅具有调节炎症的作用,还可以通过促进细胞的增殖、迁移、分化等功能促进伤口的愈合。本文主要对ADSCs-Exo在皮肤伤口愈合过程中的作用进行综述。

1 ADSCs-Exo的来源及优点

脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)是一类脂肪基质内的干细胞群,是一种能够自我更新并具有多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),能够在体外分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。ADSCs主要来源于脂肪细胞,可以利用抽脂术或从切除的脂肪中获得。与其他类型的MSCs相比,ADSCs的优势在于易获取、数量多(1 g脂肪组织提供的干细胞比1 g骨骼所提供的干细胞多500倍),并且具有独特的免疫调节功能。ADSCs不仅可以通过上调表皮生长因子和血管内皮生长因子的分泌水平来促进皮肤的再生,还可用于修复缺损的骨组织、软骨和软组织等[3]。近年来研究发现,ADSCs修复组织的过程实际上是依靠旁分泌作用来实现的,外泌体正是其旁分泌的主要产物。外泌体是一种通过内体途径分泌到细胞间隙的细胞外囊泡,直径为30～100 nm,密度为1.13～1.19 g/mL,由Johnstone等首次在绵羊血清中分离发现,含有蛋白质、mRNA、miRNA、DNA等多种物质,目前发现T细胞、B细胞、血小板、间充质干细胞等均能够分泌外泌体,血液、尿液、乳汁等体液中也均富含外泌体[4-5]。

2 ADSCs-Exo在伤口愈合中的作用

2.1 止血/炎症期 在皮肤受损后,暴露的组织因子和胶原等会激活血小板聚集[6],释放趋化因子和生长因子,在伤口形成凝块以止血;另一方面,大量的细胞也被募集到伤口周围。首先出现在损伤部位的是中性粒细胞,它浸润伤口并通过释放蛋白水解酶和氧自由基来清除细胞碎片和细菌以防止伤口感染[7],而后会以凋亡的方式被清除;之后,血液来源的单核细胞迁移至伤口部位并转化为巨噬细胞,起到吞噬细菌、细胞残体和坏死组织的作用[8],同时,吞噬细胞还会释放大量的酶和细胞因子,刺激成纤维细胞和角化细胞从而促进血管生成。

在该阶段,皮肤主要通过建立一种免疫屏障来防止外界微生物的入侵,而炎症因子的水平是其中重要的因素之一。已有研究证明,ADSCs-Exo能够显著降低特应性皮炎小鼠中各种炎性细胞因子的表达,例如白介素(interleukin, IL)-4、IL-23、IL-31等[9]。此外,ADSCs-Exo还可以通过诱导神经酰胺的合成,显著降低IL-5、肿瘤坏死因子α等炎症细胞因子的水平,进而促进特异性皮炎的表皮屏障修复[10]。Cao等[11]在小鼠皮肤损伤模型中发现,ADSCs-Exo中的miR-19b可以通过调控趋化因子CC基序配体(chemokine CC motif ligands, CCL)/TGF-β轴信号通路,促进TGF-β1的表达以促进伤口的愈合。鞘氨醇1-磷酸(sphingosine 1-phosphate, S1P)介导的信号通路在细胞的增殖和迁移、炎性因子的浸润、血管生成等许多生理和病理过程中发挥重要作用。研究发现,ADSCs-Exo可以通过激活S1P/鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1, SK1)/鞘氨醇1-磷酸受体1(sphingosine 1-phosphate receptor 1, S1PR1)信号通路,促进巨噬细胞M2极化(M2是典型的抗炎类型[12]),从而发挥抗炎作用[13]。Zhao等[14]发现ADSCs-Exo处理可以增加巨噬细胞M2和IL-10的mRNA的表达,并通过其携带的活性信号传感器和转录激活剂3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)激活精氨酸酶-1,从而诱导巨噬细胞向M2极化,抑制相关的炎症反应。

由此可见,ADSCs-Exo可以通过调节炎症因子的水平来达到抗炎、改善创面环境的效果,从而促进皮肤伤口的愈合。

2.2 增生期 该期可以分为3个阶段。第一阶段,伤口边缘的成纤维细胞和角质形成细胞向愈合区迁移,成纤维细胞在伤口处增殖并产生基质蛋白纤维连接蛋白、蛋白多糖和Ⅰ型及Ⅲ型前胶原[6,15],而胶原蛋白是伤口内细胞内基质形成的基础。Hu等[16]发现,成纤维细胞可以将ADSCs-Exo吸收并内化,进而刺激细胞的迁移、增殖和合成,从而加快伤口的愈合。Zhang等[17]的实验表明,ADSCs-Exo可以使胶原蛋白和基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1, MMP-1)的表达增加,并活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶(protein kinase B, Akt)信号通路,而PI3K/Akt信号通路对ADSCs-Exo促进成纤维细胞的增殖和迁移具有重要作用;Choi等[18]通过实验发现,ADSCs-Exo含有的miRNA可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的表达,从而刺激真皮成纤维细胞的增殖和迁移。此外,有学者通过细胞毒性试验和细胞划痕试验证实,ADSCs-Exo也能显著促进角质形成细胞的体外增殖和迁移[19]。

第二阶段,内皮细胞对多种血管因子产生应答,其中包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)和成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF),其中FGF和VEGF起主要调控作用[20]。近年来研究发现,ADSCs-Exo携带的miRNA(miR-126、miR-130a、miR-132、miR378a-3P)[21-22],不仅可以促进内皮细胞的增殖和迁移,还能通过增加血管内皮细胞中的VEGF、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)以及FGF等多种生长因子的水平而促进血管生成[23-24]。此外,Bai等[25]在小鼠皮瓣暴露导致的缺血/再灌注损伤模型中发现,ADSCs-Exo可以显著增加皮瓣的存活率和毛细血管密度,减少皮瓣的炎症反应和细胞凋亡,促进新生血管的形成。

第三阶段,巨噬细胞、增殖的成纤维细胞和血管化的间质与胶原基质、纤维蛋白原、纤维连接蛋白的透明质酸一起构成临时基质[15],并随着胶原蛋白的积累,伤口处的肉芽组织逐渐成熟,邻近的角化细胞作为上皮细胞迁移到伤口边缘并完成上皮化。从宏观角度来讲,这一过程可以看作是大量肉芽组织的形成。有学者研究了ADSCs-Exo对角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的增殖和迁移的影响,发现ADSCs-Exo很容易被内皮化,从而促进这些细胞在体内的增殖、迁移和血管生成,更重要的是,ADSCs-Exo刺激了这些细胞中的Akt和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, EPK)信号通路,在伤口局部注射ADSCs-Exo后,可显著提高伤口再上皮化、胶原沉积和新生血管形成的能力,从而加速伤口的愈合[26]。

在伤口增生阶段中,ADSCs-Exo能够通过促进细胞的增殖、迁移和分化以及血管再生,帮助伤口完成上皮化,进而促进皮肤伤口的愈合。

2.3 重塑期 在增生期的基础上,角化细胞从伤口边缘转移到临时基质中并释放细胞因子传递皮肤损伤的信息[27]。随后,整合素和细胞骨架成分重新排列,肉芽组织停止生长,胶原蛋白的合成和分解以及细胞外基质的重塑不断发生,成纤维细胞与细胞外基质相互作用,使伤口边缘更加紧密[28]。伤口愈合后,成纤维细胞和巨噬细胞在细胞凋亡的作用下进一步减少[29],随着时间推移,毛细血管不再生长,伤口部位的代谢活动减弱,最终形成完全成熟的瘢痕[30]。

2017年,Wang等[31]通过实验发现,ADSCs-Exo可以通过激活MAPK丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/ERK通路,调节Ⅲ型胶原∶Ⅰ型胶原、TGF-27a3∶TGF-27a1、基质金属蛋白酶3∶基质金属蛋白酶抑制剂1(matrix metalloproteinases-1, TIP1)的比值,抑制成纤维细胞的分化,从而抑制肉芽组织的形成,最终实现皮肤伤口无疤痕修复。2019年,Ma等[32]的实验发现,在H2O2诱导的损伤模型中,角质形成细胞HaCat经过H2O2处理后加入ADSCs-Exo,凋亡细胞明显减少,说明ADSCs-Exo能够显著抑制细胞凋亡;Wnt蛋白/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对调节皮肤伤口大小有着重要作用[33],进一步通过Western Blot实验发现,ADSCs-Exo能够提高β-catenin的表达,促进Wnt的分泌和运输[34],从而促进创面愈合。He等[35]也发现,ADSCs-Exos可显著降低H2O2对HaCat及人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts, HDF)的增殖、迁移和凋亡的抑制作用。

在重塑期阶段, ADSCs-Exo一方面可以通过调节胶原蛋白的比值抑制肉芽组织的形成,另一方面也可抑制细胞的凋亡,从而有助于伤口处组织的重建,实现伤口的无瘢痕愈合。

3 结语

总之,ADSCs-Exo在伤口愈合过程的不同阶段均发挥着积极的作用。在止血/炎症期,ADSCs-Exo能够调节伤口各类炎症因子的水平;在增生期,ADSCs-Exo可以促进血管的生成,促进伤口中各类细胞的增殖、迁移、分化;在伤口愈合的最后阶段——重塑期,ADSCs-Exo还通过抑制肉芽组织的形成和细胞的凋亡,帮助伤口处组织的重建,最终完成伤口的愈合。因此,ADSCs-Exo有望成为促进难愈合伤口愈合的新型药物。