白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其诱导凋亡作用的实验研究

汪丽娜,任若瑜,何富乐

(1永康市中医院药剂科·浙江 永康 321300;2浙江中医药大学第一临床医学院·浙江 杭州 310053)

白皮杉醇是一种多酚类化合物,其结构与白藜芦醇相似,广泛存在于甘蔗、葡萄、大戟、桂皮以及白茶树等植物[1]。白皮杉醇具有多种药理活性,例如抗氧化、抗炎、抑菌、抗衰老、抗白血病、调节免疫功能等[2-4];此外,越来越多的研究表明,白皮杉醇对乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病等多种肿瘤细胞均有明显的抑制作用[5-7],表明其具有一定的抗肿瘤能力。目前关于白皮杉醇在卵巢癌中的作用及相关的机制仍未见报道,本研究以卵巢癌细胞株SKOV-3为研究对象,旨在探讨白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其诱导凋亡作用和相关机制,为白皮杉醇的临床应用提供实验室依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞 人卵巢癌细胞SKOV-3:上海赛百慷公司。

1.2 药物与试剂 白皮杉醇:成都德思特生物技术有限公司,批号:DST190812-023。

DMEM高糖培养基:美国Hyclone公司;胎牛血清:浙江天杭生物科技公司;CCK8试剂盒:美国MCE公司,批号:#21368;结晶紫:上海强顺化学试剂公司;DAPI染料:上海碧云天公司;BCA蛋白测定试剂盒:北京索莱宝科技有限公司;Ki67 Antibody、Bcl-2 Antibody、Bax Antibody、Cleaved Caspase-3 Antibody、GAPDH Antibody:美国Affinity公司,批号:34e1264、65k2435、43k2132、48k3591。

1.3 仪器 CMaxPlus型酶标仪:美国Molecular Devices公司;Micro17R型低温高速离心机:美国Thermo公司;BB150型细胞培养箱:美国Thermo公司;AE2000型光学显微镜:中国Motic公司;Ts2-FC型倒置荧光显微镜:日本尼康公司;EPS300型电泳仪:上海天能生命科学有限公司;610020-9Q型化学发光仪:上海勤翔科学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 人卵巢癌SKOV-3细胞解冻复苏后,制成细胞悬液,接种于培养基中(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L链霉素),常规培养于37 ℃,5%CO2细胞培养箱,1～2 d换液1 次,显微镜下观察,待细胞长至对数生长期时用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后传代。

2.2 CCK8检测细胞活性 取对数生长期细胞接种于96 孔板内,随机分为空白对照组(0 μmol/L)、白皮杉醇低剂量组(20 μmol/L)、白皮杉醇中剂量组(40 μmol/L)和白皮杉醇高剂量组(80 μmol/L)。待细胞贴壁后,分别加入相应浓度的药物,继续培养24 h和48 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在培养箱内孵育。用酶标仪测定450 nm处的吸光度,计算细胞活性。相对细胞活性=(实验组OD值/空白组OD值)×100%。

2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 按照“2.2”中方法分组,用记号笔在6 孔板背后均匀划横线且横穿过孔,每孔至少穿过3 条线。取对数期的SKOV-3细胞进行铺板,细胞密度为每孔5×105个,过夜后细胞覆盖整板。第2 天用1 mL枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,划痕后用PBS洗细胞3次,除去划下的细胞,再加入无血清培养基,根据分组情况加入相应浓度的药物,继续培养24 h后观察划痕实验结果并取样拍照。利用Image J软件测量每孔多个点划痕间距,取均值,0 h 和 24 h 时划痕的宽度分别记为 A和B,迁移率=(A-B)/A。

2.4 Transwell检测细胞侵袭能力 按照“2.2”中方法分组,用无血清DMEM高糖培养液稀释Matrigel,稀释比例为3∶1,取30 μL 稀释后的Matrigel包被Transwell小室,置于4 ℃孵育过夜;取对数期SKOV3细胞按上述分组情况用相应浓度的药物处理24 h后,将Transwell小室放入24 孔培养板,上室加入SKOV3细胞,置培养箱中继续培养24 h,棉签擦掉基质胶和上室底层细胞,4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗3 次,0.1%结晶紫染液染色30 min后拍照并计数侵袭至下室中的细胞数量。

2.5 DAPI染色法检测细胞凋亡 按照“2.2”中方法分组,取对数期的SKOV-3细胞传代于24 孔板中,再以60%～70%细胞密度种板,细胞贴壁后按分组给予相应浓度的白皮杉醇,药物作用结束弃去培养液后用多聚甲醛固定细胞10 min,PBS清洗2次, 然后DAPI核染 (1 mg/L DAPI作用2 min);再次PBS液洗2 次后无菌水洗1次。在载玻片上滴甘油, 载玻片上小心黏附盖玻片, 在荧光显微镜下观察细胞并拍照。凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数。

2.6 Western blot检测Ki67、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达 按照“2.2”中方法分组,取对数期SKOV-3细胞传代于6 cm培养皿,按分组情况用相应的浓度的药物处理后,提取蛋白。配制浓度为10%的 SDS-PAGE胶,蛋白上样量为30μg,在60 V恒压下进行电泳至分离胶处,再以110 V电泳60 min左右。以300 mA恒流湿转2 h,室温状态下用浓度为5%脱脂牛奶进封闭1 h,一抗4 ℃孵育过夜。次日,用TBST清洗3 次,清洗后在室温下孵育二抗,孵育1 h,再次用TBST清洗,清洗3 次,每次5 min,用ECL显色液孵育3 min,使用凝胶成像系统成像。采用Image J软件分析蛋白条带的灰度值。

3 结果

3.1 白皮杉醇对SKOV-3细胞增殖的影响 见表1。

表1 干预24 h、48 h 各组SKOV3细胞活性检测结果

3.2 白皮杉醇对SKOV-3细胞迁移能力的影响 见表2,图1。

图1 各组SKOV3细胞迁移能力(×40)

表2 各组SKOV3细胞迁移率比较

3.3 白皮杉醇对SKOV-3细胞侵袭能力的影响 见图2,表3。

图2 各组SKOV3细胞侵袭能力(×200)

表3 各组SKOV3细胞侵袭能力比较个)

3.4 白皮杉醇对SKOV-3细胞凋亡的影响 表4,见图3。DAPI染色法检测白皮杉醇对SKOV-3细胞凋亡的影响。由图3可知,与空白对照组比较,白皮杉醇低、中、高剂量组中的凋亡细胞数量明显增多;由表4可知,与空白对照组比较,白皮杉醇低、中、高剂量组中的细胞凋亡率逐渐升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。

图3 各组SKOV3细胞凋亡情况(×200)

表4 各组SKOV3细胞凋亡率比较

3.5 白皮杉醇对SKOV-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响 见图4～图5。由图4、图5可知,与空白对照组比较,白皮杉醇低、中、高剂量组中的Ki67和Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。

A.空白对照组;B.白皮杉醇低剂量组;C.白皮杉醇中剂量组;D.白皮杉醇高剂量组图4 各组SKOV-3细胞Ki67、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase3蛋白表达的Western blot检测结果

与空白对照组比较,图5 各组SKOV-3细胞Ki67、Bcl-2、bax和Cleaved caspase-3蛋白表达的比较

4 讨论

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一, 全世界每年约有20 万名女性被确诊为卵巢癌, 其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第3位[8]。卵巢癌起病隐匿, 早期症状不典型, 大多数患者确诊时已至晚期[9]。因此,探讨卵巢癌的增殖以及侵袭转移机制,寻找新的治疗策略,对改善预后,延长患者生存期具有重要的临床意义。

白皮杉醇具有与白藜芦醇相似的生物活性,其抗氧化活性强于白藜芦醇,而且白皮杉醇具有相对较低的毒副作用[10]。大量体外研究结果表明,白皮杉醇具有抑制前列腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡的作用,具有一定的抗肿瘤活性[11]。本研究探讨白皮杉醇对人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力等影响及凋亡的诱导作用,并初步探讨其作用机制。

CCK8实验结果显示,SKOV-3细胞经白皮杉醇干预后存活率明显降低,且降低程度与用药时间和浓度呈正相关,初步证实白皮杉醇对卵巢癌细胞的增殖活性具有一定的抑制作用。细胞划痕实验研究表明,白皮杉醇能够有效抑制卵巢癌细胞的迁移能力。Transwell侵袭实验结果表明,白皮衫醇能够有效抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式,是细胞在发育过程中通过调控细胞内基因及其产物而发生的一种死亡过程[12],研究细胞凋亡对探究抗肿瘤机制具有重要意义。DAPI染色结果表明,白皮杉醇干预后SKOV-3细胞凋亡数量明显增加,细胞凋亡水平与药物剂量呈正相关。Caspase家族蛋白质是凋亡相关蛋白的重要组成部分,与细胞凋亡的发生和发展息息相关[13];另外,由Bax等促凋亡蛋白以及Bcl-2等抗凋亡蛋白组成的Bcl-2家族蛋白也是凋亡过程中的重要调节因子。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白在正常生理环境下维持在一种平衡的状态,这种平衡状态一旦被打破,将导致细胞凋亡[14-15]。Western blot结果显示白皮杉醇干预后,Bcl-2蛋白的表达下调,Bax蛋白和cleaved Caspase-3蛋白表达明显上调,同时细胞增殖相关蛋白Ki67表达显著下调。进一步从蛋白水平证实白皮杉醇能够诱导SKOV-3细胞凋亡,抑制SKOV-3细胞增殖。

综上所述,白皮衫醇能够显著抑制SKOV-3细胞的增殖、迁移及侵袭,并能够有效诱导SKOV-3细胞凋亡。