加味参芪地黄汤对糖尿病肾病大鼠足细胞自噬的影响

李莲花,程楚楚,张佩青,杨 馨,陈 明,尚国旗,王海艳,于 卓

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

参芪地黄汤出自清·沈金鳌《杂病源流犀烛》,为脾肾双补之剂[1]。加味参芪地黄汤是笔者根据多年临床经验总结出的治疗DN的有效方剂,在参芪地黄汤基础上加入活血化瘀通络之品而成,在临床应用多年,疗效稳定。前期研究证实加味参芪地黄汤能够调节Ⅲ、Ⅳ期糖尿病肾病患者VEGF、Ang-2、MCP-1、TNF-α水平,对早中期气阴两虚兼血瘀型糖尿病肾病患能够降低尿蛋白,改善肾功能,调节糖脂代谢,气阴两虚兼血瘀证的临床证候,下调尿中AGEs和PKC表达水平[2-4]。本研究采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)腹腔注射制备DN大鼠模型,观察加味参芪地黄汤对DN大鼠肾脏足细胞自噬的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠50只,8周龄,体质量(200±20)g;由哈尔滨医科大学实验动物学部提供,动物合格证号:SCXK(黑)2019-001。饲养于黑龙江省中医药科学院实验动物中心,饲养条件:温度(22～24)℃、湿度55%～60%,12 h/12 h光照黑暗循环,保持良好通风,自由摄食饮水。

1.2 实验药物和试剂

加味参芪地黄汤组成药味颗粒剂(黄芪、党参、熟地、生地、山药、山茱萸、丹皮、茯苓、泽泻、枸杞、菟丝子、当归、地龙、桃仁)由华润三九医药股份有限公司提供,水煎浓缩成膏,每1 g膏方含生药5 g。洛汀新片:诺华公司,批号:X325,规格:10 mg/片。高糖高脂饲料(配料:67%正常饲料,20%蔗糖,10%猪油,2.5%胆固醇,0.5%胆酸钠):北京科澳协力饲料有限公司。链脲佐菌素(STZ):北京索莱宝科技有限公司; bs-8878R Anti-LC3、bs-4005R Anti-Atg5:北京博奥森生物技术有限公司;免疫组织化学法兔二步法检测试剂盒:中杉金桥ORIGENE。

1.3 实验仪器

LDZM-60KCS-Ⅱ立式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;超纯水系统:美国密理博公司;BSA224S天平:德国赛多利斯公司;BX41荧光显微镜:日本奥林巴斯公司。

2 方法

2.1 动物模型制备

50只大鼠随机取10只作为正常对照组,予常规清洁级饲料;其余40 只大鼠予高糖高脂饲料喂养8 周后,于第8周末禁食不禁水12 h,STZ(35 mg/kg)一次性腹腔注射[5],注射后的第7天大鼠尾静脉采血,以随机血糖>11.1 mmol/L作为糖尿病模型成模标准。在此基础上,继续高糖高脂饲料喂养1 个月后,以随机血糖≥16.7 mmol/L,24 h尿蛋白定量> 30 mg 视为DN模型成功[6]。期间有4 只大鼠死亡。

2.2 分组及给药

将造模成功的36 只大鼠随机分为模型组,阳性对照组和中药高剂量组、 低剂量组,每组9 只。中药组以加味参芪地黄汤44.10 g/kg(高剂量组)、11.03 g/kg(低剂量组)灌胃给药,阳性对照组予洛汀新0.9 mg/kg灌胃;每次灌胃药液体积 1 mL/100 g;正常对照组、模型组给予等体积生理盐水灌胃;每天1次,连续给药8周。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 肾组织病理变化观察 末次给药后,禁食不禁水12 h,10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉,处死大鼠取一侧肾脏立即投入10%多聚甲醛溶液固定,用于制作石蜡切片。HE染色:风箱调制65 ℃烤片30 min;常规脱腊水化;置苏木精溶液内30 min染色;自来水洗去浮色,以1%的盐酸酒精分色,0.5%～1%伊红溶液复染1～10 min;待胞质染成红色,梯度脱水透明(50%、70%、80%、90%乙醇各3 min,95%、100%乙醇I、II各3 min,二甲苯I、II各10 min;中性树胶封片。光学显微镜下观察(400×)。Masson染色:石蜡切片脱蜡水化,苏木精溶液染色5～10 min,充分水洗,用Masson丽春红酸性复红液染5～10 min,2%冰醋酸溶液浸洗,1%的磷钼酸分化3～5 min,苯胺蓝染5 min,0.2%冰醋酸水溶液清洗片刻,脱水透明,中性树胶封固。光学显微镜下观察(400×)。

2.3.2 肾组织Atg5、LC3表达的免疫组化检测 ①枸橼酸缓冲液配制, ②脱蜡, ③水化,④抗原修复, ⑤滴加一抗, ⑥第二天PBS5 min×3, ⑦滴加试剂2(反应增强液), ⑧滴加试剂3室温孵育30 min, ⑨DAB显色, ⑩复染苏木复染≦1 min,用自来水冲洗盐酸酒精30 s再梯度酒精脱水透明(85%乙醇1 min)95%乙醇1 min无水乙醇1 min×2透明二甲苯5 min,封片。结果判定:阳性表达为肾小球区域棕黄色颗粒,每张切片选取光镜下 10 个不重复视野(400×),利用 Image J 软件计算阳性面积的平均吸光度值,计算 10 个不同视野的均值,并将其作为免疫组织化学半定量结果。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠肾组织病理变化

3.1.1 肾组织HE染色结果 正常组肾组织结构正常,未见系膜及系膜基质增生。模型组出现肾小球系膜基质弥漫重度增生,基底膜略增厚、肾小管空泡变性脂肪变性,间质淋巴大量增生。与模型组比较,各给药组病变减轻,以加味参芪地黄汤高剂量组改善最明显。见图1。

图1 各组大鼠肾组织HE染色结果(HE,×400)

3.1.2 肾组织MASSON染色结果 正常组大鼠肾小球基底膜、系膜基质均正常,未见间质纤维化。模型组肾小管呈空泡样脂肪变性,肾间质纤维化。与模型组相比,各给药组病变减轻,以加味参芪地黄汤高剂量组改善最明显。见图2。

图2 各组大鼠肾组织Masson染色结果(Masson,×400)

3.2 各组大鼠肾组织Atg5、LC3表达的免疫组化检测结果 正常组Atg5、LC3阳性细胞核数量丰富;与正常组相比,模型组肾小球Atg5、LC3阳性细胞核数量明显减少(P<0.05);与模型组相比,加味参芪地黄汤高剂量组肾小球Atg5、LC3阳性细胞核数量明显增多(P<0.05),见图3～图4,表1。

表1 各组大鼠肾组织Atg5、LC3表达比较

图4 各组大鼠肾组织LC3表达的免疫组化检测结果(×400)

4 讨论

糖尿病肾病(DN)属中医学“消渴”范畴,是糖尿病微血管并发症之一,以蛋白尿、浮肿为特征。消渴日久脾肾两虚,瘀血阻滞肾络,导致肾失封藏,精微物质从小便流失。《圣济总录》指出:“肾,水也,脾土制之,水乃下行”[7]。《血证论》“瘀血在里,则口渴……瘀血去则不渴也”[8],说明血瘀可导致消渴病。DN的总体病机为脾肾两虚,瘀阻肾络;脾肾亏虚为本,“肾络瘀阻”为标,故治宜健脾补肾、活血通络。加味参芪地黄汤方中用参芪促气化之功;用当归补血活血,入地龙、桃仁以奏活血祛瘀之效;余药取熟地、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮,以其“三补三泻”之用补虚损、渗湿浊、清虚热;菟丝子、枸杞子健脾补肾、填精益髓。全方共奏益气养阴、健脾补肾、活血通络之功,用治DN取得了较好疗效[2-4]。

自噬是人体细胞自我修复的一种重要手段,通过双层膜结构包裹受损细胞器和蛋白质形成自噬体,降解后释放能量供细胞使用。在DN中足细胞自噬起到缓解蛋白尿,减轻肾脏损伤的作用[10]。在调控自噬平衡的过程中,各种自噬相关蛋白、细胞信号传导通路及一些miRNA起重要作用[11]。细胞需要多种自噬相关蛋白ATGs来感知和产生膜曲率,促进自噬体膜的产生[12]。LC3脂化有助于自噬体运输,指导自噬体/溶酶体融合事件[13]。

本实验结果显示加味参芪地黄汤可以增加DN大鼠肾组织Atg5、LC3表达,减轻肾组织病理变化;中药高剂量组作用显著。提示加味参芪地黄汤能够促进DN大鼠的足细胞自噬,改善肾组织病理损伤。