青礞石抗乌头碱致大鼠室性心律失常作用及对心肌组织P38 MAPK表达的影响

尚宜志,郭茂松,张守红

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

随着人们生活水平的提高,心脏疾病已经成为世界性问题。其中以室性早搏(premature ventricular beats,PVC)为主的心脏病成为当今医学界难以有效解决的问题,严重影响人们的生活质量及生命安全[1-2]。非药物治疗如射频消融术(catheterradiofrequency ablation,RFA)、埋藏式心脏转复除颤器(Implantable cardioverter-defibrillator,ICD)等受到患者经济能力的限制,接受度不高。抗心律失常的治疗药物中,部分药物在缺血和左室功能不全的情况下会导致患者的死亡率增加[3-5]。

在中医学中,心律失常归属为“惊悸”“怔忡”等范畴,病因分为虚证与实证两方面。实证多为痰阻经络、痰蒙心窍致心神失养,或心脉不畅,引心中悸动不安[6]。既往文献报道中,中药治疗心律失常,主要包括以黄芪、人参为主的补益药,赤芍、生地黄为主的清热药和丹参、川芎为主的化瘀药居多[7-8];但对于具有坠痰下气功效青礞石类药的应用报道较少。

青礞石最早载于北宋仁宗年间的《嘉祐本草》,来源于黑云母片岩、绿泥石化云母碳酸盐片岩[9]。青礞石具有祛痰、镇惊、平肝、下气的功效,多用于治疗癫痫、咳嗽、小儿抽动秽语综合征、呃逆、肾病综合征、水肿、胆石症、消化性溃疡、精神分裂症等表现为咳逆喘急、烦躁胸闷等属于痰热阻滞证候的疾病[10]。但关于青礞石相关制剂治疗室性心律失常的鲜有报道。在临床应用中,青礞石对室性心律失常表现出显著的治疗效果,但其具体作用机制尚不清楚[11]。本研究通过动物实验观察青礞石抗室性心律失常的作用,并探讨其抗心律失常的作用机制,为临床应用提供数据支持。

1 材料

1.1 实验动物 健康SD大鼠40只,雌雄各半,7 周龄,体质量(200±20)g,购于哈尔滨医科大学实验动物中心,动物许可证号:SCXK(黑)2019-001,严格遵循黑龙江省中医药科学院实验动物伦理委员会相关规定。饲养条件:温度(21±2)℃,相对湿度(50±15)%,12 h昼夜循环,自由进食标准饲料。大鼠标准饲料购于北京科澳协力饲料有限公司,标准饲料由60%碳水化合物,21%蛋白质和19%脂肪所组成。

1.2 药物及试剂 青礞石颗粒:购于江阴天江药业有限公司。青礞石栓剂制备:(1)采用青礞石颗粒0.5 g(相当于原药材10 g),倒入研磨器皿中,用研磨锤研磨2 min,研成极细粉备用。(2)向加热器皿中加入青礞石细粉,加水1 000 mL浸泡2 h,武火煮沸30 min,改文火煎煮1 h,过滤药液300 mL,滤液浓缩至相对密度为1.20(50 ℃),按照调配的比例加入0.5%的S80,13.5%的青礞石浓缩液,86%的吐温40,置于70℃的恒温水浴锅上边加热边搅拌,加热30 min,使其全部熔融,迅速倒入涂有液体石蜡的颗粒模具中,2 h后起模,在紫外线灯下照射20 min,制备成成品青礞石栓,每粒试药制剂相当于青礞石颗粒0.027g(生药0.54 g),置于干燥阴凉处30 ℃以下密闭贮存。乌头碱(10 g/mL)购自成都曼思特生物科技有限公司,货号:A0196;石蜡:上海绩祥生物科技有限公司,货号:SH7445498;吐温40:上海源叶生物科技有限公司,货号:S15017;P38丝裂原激活蛋白激酶(P38 MAPK)抗体:Abcam公司,货号:ab170099;磷酸化P38丝裂原激活蛋白激酶(p-P38 MAPK)抗体:Abcam公司,货号:ab4822;GAPDH抗体:碧云天生物技术有限公司,货号:AF2819。

A.模型组;B.青礞石颗粒高剂量组;C.青礞石颗粒中剂量组;D.青礞石颗粒低剂量组图1 各组大鼠心肌组织P38 MAPK、p-P38 MAPK蛋白表达的Western Blot检测结果

1.3 实验仪器 J-HH-6A恒温水浴锅:上海胜卫电子科技有限公司;DE03-VET心电图仪:山东来影医疗科技有限公司;蛋白电泳槽:Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 动物分组与造模 40只SD大鼠,分笼喂养2周后,按体质量及摄食量将所有SD大鼠分为以下4 组,分别为模型组和青礞石高剂量组(0.54 g/kg)、青礞石中剂量组(0.27 g/kg)、青礞石低剂量组(0.135 g/kg),每组10只;模型组直肠给药硬脂酸栓,青礞石3 剂量组直肠给药,每天1 次,连续给药2周。

2.2 观察指标及检测

2.2.1 ECG指标监测 于末次给药1 h后,20%乌拉坦(1 g/kg)腹腔麻醉,大鼠背位固定,由股静脉以5 μg/min恒速泵入乌头碱(20 μg/kg),对各组SD大鼠采用标准Ⅱ导联监测ECG,记录各组大鼠乌头碱(10 g/mL)溶液注入后PVC、VF、SCA发生率、开始时间及乌头碱用量。

2.2.2 Western blot检测心肌组织P38 MAPK蛋白表达 ECG记录结束后,采用脊椎脱臼法处死大鼠,取大鼠心脏,4 ℃预冷生理盐水冲洗,铝箔纸包裹标记,-80 ℃冰箱保存。将100 mg心肌组织在裂解液中浸润30 min,匀浆处理提取心肌组织蛋白,BCA方法测定其浓度。12 000 g离心15 min(4 ℃),取上清液进行蛋白变性处理,100 ℃沸水加热8 min。结束后于冰上骤冷,-20 ℃保存。12%分离胶中加入30 μg样品。将分离的目的蛋白转到PVDF膜上;室温状态封闭2 h;P38(1∶2 000)或p-P38(1∶2 000)一抗4 ℃过夜,次日1×TBST摇床匀速洗涤3 次,每次10 min。二抗25 ℃孵育2 h,1×TBST摇床再次匀速洗涤3 次,每次10 min。通过超敏发光液测定免疫反应条带并通过Bio-Rad系统定量分析,计算结果。

2.3 统计学分析 计量资料用平均值±标准差表示,多组间比较应用单因素方差分析;计数资料采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。

3 结果

3.1 各组大鼠PV、VF、SCA发生率比较 与模型组比较,青礞石高、中剂量组PVC、VF、SCA发生率明显减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠PVC、VF、SCA发生率比较[只(%)]

3.2 各组大鼠PVC、VF、SCA开始时间的比较 与模型组比较,青礞石高、中、低剂量组PVC、VC、VF、SCA开始时间明显延长(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠 PVC、VF、SCA开始时间比较

3.3 各组大鼠乌头碱中毒剂量比较 与模型组比较,青礞石高、中、低剂量组均能增加诱发PVC、VF、SCA的乌头碱消耗量(P<0.05),表明青礞石有显著抗心律失常的作用。见表3。

表3 各组大鼠乌头碱中毒剂量比较

3.4 各组大鼠心肌组织P38 MAPK、p-P38 MAPK蛋白表达比较 见图1,表4。

表4 各组大鼠心肌组织P38 MAPK、p-P38 MAPK蛋白表达比较

4 讨论

室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)是临床最常见的一种心律失常,其发生机制非常复杂,多数由心脏自律异常或心电传导障碍导致,可单独发病或伴其他心血管疾病。该病致心肌受损严重,且心源性猝死发生率显著增高,成为医学研究的世界性难题[12]。临床治疗中,无论是西药治疗还是射频消融术治疗,都无法达到彻底纠正室性早搏的病理状态。

青礞石为临床常用的矿物质中药,且应用历史悠久,广布于浙江、河南、山东、湖南、辽宁、湖北、山西等地。本品咸、甘、性平,质重,主下行,归心、肺、肝经,具有平肝镇惊、坠痰下气之功效,凡痰热内结,日久不化,壅塞胶固所致的气逆,咳痰黄稠、惊痫、癫狂等症,应用十分广泛[10]。《玉楸药解》载,青礞石“味咸,气平,入手太阴肺、足太阴脾经。化痰消谷,破积攻坚”,《雷公炮制药性解》载,青礞石“辛宜于肺,甘宜于胃。主荡涤宿痰,消磨食积”,《本草纲目》载,青礞石的功效“治积痰惊痫,咳嗽喘急”,《本草从新》载,“能平肝下气,为治顽痰癖结之神药”[13-14]。前期临床观察结果显示青礞石对痰火扰心和痰蒙心窍型的心律失常有显著疗效,动物实验显示青礞石具有抗心律失常作用[11,15],但对于其具体的作用机制缺乏数据。

本实验通过建立乌头碱诱导SD大鼠室性心律失常动物模型,研究青礞石抗室性心律失常的作用。临床应用中,部分患者平素脾胃虚弱,青礞石咸,寒,质重,主下行,口服汤药常致腹痛、腹泻等症状,导致治疗效果欠佳,本实验采用直肠给药方式,避免青礞石对消化系统的刺激作用。结果显示:与模型组相比,青礞石高、中剂量组PVC、VF、SCA发生率显著降低(P<0.05),PVC、VF、SCA开始时间延长(P<0.05),诱发PVC、VF、SCA产生的乌头碱消耗量均增加(P<0.05);表明青礞石可治疗乌头碱致SD大鼠室性心律失常。

P38 MAPK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶超家族的重要组成部分,可通过传递胞内信号,以参与调控多种细胞内应答,如细胞应激、炎症反应、凋亡等,在心肌缺血再灌注损伤中发挥十分重要的作用[16]。既往研究表明,P38 MAPK表达的增加会促进心肌梗死后心肌细胞的炎症反应,加剧细胞凋亡[17];P38 MAPK表达的下调,可显著降低心肌细胞的凋亡,发挥心肌细胞保护作用[18]。本研究结果表可见,随青礞石剂量的增加,p-P38 MAPK表达逐渐下降,表明其可能通过抑制p-P38 MAPK表达,抑制心肌细胞凋亡,进而达到保护心脏的作用。

综上所述,青礞石可显著抑制乌头诱导的室性心律失常,并抑制乌头碱的心肌毒性,抑制p-P38 MAPK表达是其作用机制之一。